檢測甲霜靈殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒及使用方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于酶聯(lián)免疫檢測領域，具體涉及一種用于檢測甲霜靈藥物殘留的酶聯(lián)免 疫試劑盒，其特別適用于煙草、茶葉、蔬菜樣本中甲霜靈殘留的檢測。
【背景技術】
[0002] 甲霜靈（Metalaxyl)，D, L-N_(2, 6-二甲基苯基）-N_(2'-甲氧基乙酰）丙氨酸甲 酯，是一種新型的具有保護和治療作用的內吸性殺菌劑，可被植物的根、莖、葉吸收，并隨 植物體內水分運轉而轉移到植物的各器官，可以作莖葉處理、種子處理和土壤處理，對霜霉 菌、疫霉菌、腐霉菌所引起的病害有效，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用來治療葡萄霜霉病、黃瓜霜霉病、 黃瓜角斑病、辣椒疫病、煙草黑脛病、馬鈴薯晚疫病、番茄晚疫病、水稻立枯病、水稻青枯病、 水稻惡苗病、玉米莖基腐病、玉米絲黑穗病、谷子白發(fā)病等病害，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和管理中，用途 廣泛。
[0003] 甲霜靈屬苯基酰胺類，高效、低毒、低殘留農(nóng)藥，其內吸和滲透力很強，施藥30分 鐘即可在植物體內上下傳導，對病害植株有保護和治療作用，且藥效持續(xù)期長，故殘效期 長，從而造成其在農(nóng)作物上的殘留。我國針對不同作物，制定了甲霜靈最大殘留限量標準， 其中黃瓜、辣椒、番前的最大殘留限量為0. 5mg/kg,糙米的最大殘留限量為0. lmg/kg，其他 谷物最大殘留限量為〇. 〇5mg/kg。在實際生產(chǎn)中，以2mg/kg作為煙草最大殘留量判定標準。
[0004] 從現(xiàn)有技術和相關檢測標準看，目前針對甲霜靈殘留的檢測方法主要是儀器方 法，最常用的方法是LC-UV、LC-MS和LC-MS/MS，儀器方法具備檢測靈敏度高、特異性強等優(yōu) 勢，但是檢測樣本前處理繁瑣、耗時，樣品還需提取和凈化處理，同時儀器檢測方法需要昂 貴的大型儀器和設備，配備專業(yè)的檢測技術人員，進行操作和管理，無法進行現(xiàn)場大規(guī)模檢 測，時效性差，難以推廣。
[0005] 近年來藥物殘留免疫檢測技術已經(jīng)在食品質量安全快速檢測中，得到了廣泛的應 用，且逐漸被人們所認可，酶聯(lián)免疫檢測技術具有樣品前處理簡單，檢測快速、靈敏、特異性 好、準確度高等特點，能夠滿足現(xiàn)場快速檢測的要求，從而彌補儀器檢測的不足。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種能夠檢測甲霜靈殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒，采用間接競 爭ELISA方法，并提供一種高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量檢測方法和 試劑盒制備方法，該方法對煙草、茶葉和蔬菜的檢測限為100 μ g/kg，靈敏度為1 μ g/kg。
[0007] 本發(fā)明所述的試劑盒，它包括：包被有包被原的酶標板、甲霜靈標準品溶液、高濃 度標準品、酶標二抗、抗體濃縮液、底物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液，所述包被原為甲霜 靈偶聯(lián)抗原，所述酶標二抗為酶標記抗抗體。
[0008] 所述甲霜靈偶聯(lián)抗原是由甲霜靈半抗原與載體蛋白偶聯(lián)得到，所述甲霜靈半抗原 是由水解反應得到，所述載體蛋白可為鼠血清蛋白、甲狀腺蛋白、牛血清白蛋白、兔血清蛋 白、人血清蛋白、卵清蛋白、血藍蛋白或纖維蛋白原。
[0009] 所述甲霜靈特異性抗體是以甲霜靈偶聯(lián)抗原作為免疫原制備獲得，所述甲霜靈特 異性抗體可為甲霜靈單克隆抗體或甲霜靈多克隆抗體，其中優(yōu)選甲霜靈單克隆抗體。
[0010] 所述抗抗體為羊抗鼠抗抗體或羊抗兔抗抗體，其中優(yōu)選羊抗鼠抗抗體。
[0011] 所述酶標二抗的標記酶為辣根過氧化物酶或細菌提取堿性磷酸酯酶，其中優(yōu)選辣 根過氧化物酶；酶標記的抗抗體是采用戊二醛法或過碘酸鈉法將標記酶與抗抗體進行偶聯(lián) 得到的。
[0012] 為了更方便現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣本篩查，所述試劑盒還包括甲霜靈標準品溶液、底 物顯色液、終止液、洗滌液、復溶液。
[0013] 所述標準品溶液6瓶，濃度分別為0 μ g/L、1 μ g/L、3 μ g/L、9 μ g/L、27 μ g/L、 81 μ g/L〇
[0014] 當標記酶為辣根過氧化物酶時，所述顯色液由底物顯色液A液和底物顯色液B液 組成，底物顯色液A液為過氧化氫或過氧化脲，底物顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯 胺，所述終止液為l_2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為堿性磷酸酯酶時，所述顯色 液為對硝基磷酸鹽緩沖液，所述終止液為l_2mol/L氫氧化鈉溶液。
[0015] 所述洗滌液優(yōu)選為pH值為L 2-7. 5,含有0· 8%-L 0%吐溫-20、0· 03%。_0· 05%〇疊 氮化鈉防腐劑、〇. 1-0. 3mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積百分比。
[0016] 所述復溶液優(yōu)選為pH值為7. 0、0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體 積百分比。
[0017] 其中在酶標板制備過程中所用到的包被緩沖液為pH值為9. 2-9. 6,0. 1-0. 2mol/L 的碳酸鹽緩沖液，封閉液為pH值為7. 1-7. 5,含有1%-3%酪蛋白、0. 1-0. 3mol/L的磷酸鹽緩 沖液，所述百分比為重量體積百分比。
[0018] 本發(fā)明中酶標板的制備過程為：用包被緩沖液將包被原稀釋成20 μ g/ml，每孔加 入100 μ 1，37°C避光孵育2h或4°C過夜，傾去孔中液體，用洗滌液洗滌1次，停留30s，拍干， 然后在每孔中加入150 μ 1封閉液，37°C避光孵育l_2h，傾去孔內液體拍干，干燥后用鋁膜 真空密封保存。
[0019] 本發(fā)明的檢測原理為： 在酶標板上預包被甲霜靈偶聯(lián)抗原，加入樣本溶液或標準品溶液后，再加入甲霜靈特 異性抗體溶液，樣本中殘留的甲霜靈藥物與酶標板上包被的甲霜靈偶聯(lián)抗原競爭甲霜靈特 異性抗體，加入酶標二抗進行放大作用，用顯色液顯色，樣本吸光度值與甲霜靈藥物的含量 呈負相關，與標準曲線比較即可得到樣本中甲霜靈的殘留量；同時根據(jù)酶標板上顏色的深 淺，與系列濃度的甲霜靈標準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中甲霜靈殘留量的濃度范 圍。
[0020] 本發(fā)明檢測甲霜靈的酶聯(lián)免疫試劑盒主要采用競爭ELISA方法定性或定量檢測 樣品中甲霜靈的含量；對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單，能同時快速檢測大批 量樣品；主要試劑以工作液的形式提供，檢驗方法方便易行，具有特異性高、靈敏度高、精確 度高、準確度高等特點。本發(fā)明的酶聯(lián)免疫試劑盒，結構簡單、使用方便、價格便宜、攜帶便 利、檢測方法高效、準確、簡便、適于大批量樣品篩選的定性、定量。
【附圖說明】
[0021] 圖I :甲霜靈半抗原合成路線圖； 圖2:試劑盒標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0022] 下面結合具體的實施例來進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本 發(fā)明，而不用來限制本發(fā)明的范圍。
[0023] 實施例1試劑盒組分的制備 1、甲霜靈半抗原的制備 甲霜靈溶于乙醇中，常溫下攪拌加入10% NaOH水溶液，用TLC薄層板監(jiān)測反應進行，直 至沒有原料或原料點很淺，停止反應，凈化，甲醇重結晶，得水解產(chǎn)物，經(jīng)核磁、紅外和質譜 鑒定，甲霜靈半抗原合成成功。
[0024] 2、抗原的制備 免疫原制備一一甲霜靈半抗原與牛血清白蛋白（BSA)偶聯(lián)得到免疫原。
[0025] 稱取26. 5mg半抗原溶解于2mL DMF溶液中，加入各60mg EDC和NHS (溶于2mL水 中）進行活化30分鐘，加入到110-264mg載體蛋白BSA (溶于5mL水中）進行偶聯(lián)制備出免 疫原，用0. 02mol/L PB緩沖液透析3天，每天早晚更換透析液，以除去未反應的小分子物 質；透析完成后用于動物免疫制備出抗體。分裝，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0026] 免疫原制備--甲霜靈半抗原與卵清蛋白（OVA)偶聯(lián)得到免疫原。
[0027] 稱取26. 5mg半抗原溶解于2mL DMF溶液中，加入各60mg EDC和NHS (溶于2mL水 中）進行活化30分鐘，加入到110-264mg載體蛋白OVA (溶于5mL水中）進行偶聯(lián)制備出免 疫原，用0. 02mol/L PB緩沖液透析3天，每天早晚更換透析液，以除去未反應的小分子物 質；透析完成后用于動物免疫制備出抗體。分裝，于_20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0028] 3、甲霜靈單克隆抗體的制備 動物免疫：將上述步驟得到的免疫原注入到Balb/c小鼠體內，免疫劑量為150 μ g/只， 使其產(chǎn)生抗血清。
[0029] 細胞融合和克隆化：小鼠血清測定結果較高后，取其脾細胞，按8:1 (數(shù)量配比）比 例與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。利用有限 稀釋法對陽性孔進行