髓過氧化物酶測定試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種髓過氧化物酶測定試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 血清髓過氧化物酶（myeloperoxidase，ΜΡ0)是較具有代表性的血清炎癥標(biāo)記物。
[0003] 目前在臨床上使用的MPO檢測方法有：放射免疫法（IRA)，此法直接可以測血漿， 但該法有環(huán)境污染以及對操作者有一定有放射性輻射；化學(xué)發(fā)光法，該法較放射免疫法較 為敏感，準(zhǔn)確，但成本相對昂貴，需要配套的儀器才可以使用；酶免疫法（ELISA)，存在操作 繁瑣，標(biāo)本需要預(yù)處理，檢測時間長等缺點(diǎn)。而膠乳增強(qiáng)免疫比濁法具有操作簡便，快速，檢 測靈敏度高、特異、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，在臨床應(yīng)用能得到廣泛認(rèn)可。
[0004] 現(xiàn)有膠乳免疫比濁試劑，由于其檢測原理是測定反應(yīng)形成的免疫復(fù)合物的濁度， 因此極易受到乳糜干擾的影響。目前應(yīng)對這個問題的方法，主要是使用專門的乳糜消除劑 對樣本進(jìn)行預(yù)處理。而在大規(guī)模的人群普查、健康體檢篩查和臨床病人檢驗(yàn)時，經(jīng)常會遇到 大量的乳糜、溶血等渾濁樣本，此時通過購置樣本處理劑，對這些樣本進(jìn)行單獨(dú)處理，將會 極大地增加操作人員的工作量，提高運(yùn)營成本，也為臨床檢驗(yàn)的組織安排帶來難題。
[0005] 因此，研制一種能夠消除乳糜干擾的膠乳免疫比濁法的髓過氧化物酶測定試劑盒 顯得十分必要。
[0006] 中國專利文獻(xiàn)CN102680676A公開了一種用比濁法測定的髓過氧化物酶測定試劑 盒，具有操作簡便，快速，檢測靈敏度高、特異、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但是仍存在乳糜干擾的問 題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是建立一種檢測方法，通過抗乳糜試劑R3的加入，使得乳糜干擾大 為降低。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案是： 髓過氧化物酶測定試劑盒，包含試劑Rl，R2以及校準(zhǔn)液；所述試劑Rl為pH值7. 0-8. 0 的緩沖液，所述試劑R2為抗人MPO抗體膠乳試劑；所述校準(zhǔn)液為含有定量的MPO的重組蛋 白或者是從人血清中提取出來的天然ΜΡ0,其特征在于，所述試劑盒還包括用于消除乳糜 的試劑R3,所述試劑R3包含辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二 醇-硫酸菊聚糖鎂。
[0009] 優(yōu)化地，所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯20-50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂100-200。
[0010] 優(yōu)化地，所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯20-50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂100-200 乙酸丁酸纖維素20-80。
[0011] 優(yōu)化地，所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯20-50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂100-200 羥甲基纖維素鈉20-100 乙酸丁酸纖維素20-80。
[0012] 發(fā)明人在研究中得出，在特定比例的辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙 二醇醚和聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂的混合分散系中，乳糜會發(fā)生沉降，同時不影響正常的 膠乳比濁法。
[0013] 實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，添加適當(dāng)比例的羥甲基纖維素鈉或乙酸丁酸纖維素，會使沉淀后的 乳糜更為穩(wěn)定。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面以具體的實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。
[0015] 實(shí)施例1 一種采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法檢測MPO含量的試劑盒，包含試劑Rl，R2以及校準(zhǔn)品； 所述試劑Rl : PH值為6. 5-8. 0的緩沖液，所述試劑R2為抗人MPO抗體膠乳試劑；所述標(biāo) 準(zhǔn)品為含有定量的MPO的重組蛋白或者是從人血清中提取出來的天然ΜΡ0,所述的MPO檢 測試劑盒中的Rl試劑主要包含緩沖液，無機(jī)鹽，加速劑和防腐劑，所述的MPO檢測試劑盒 中R2試劑主要包含穩(wěn)定劑，抗人單（多）克隆抗體膠乳顆粒，緩沖液，穩(wěn)定劑和防腐劑。其 中乳膠微球直徑為60-150nm。試劑Rl所述的無機(jī)鹽選自氯化鈉，氯化鎂，氯化鉀一種或幾 種。緩沖液為：磷酸鹽緩沖液，碳酸鹽緩沖液，甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液。加速劑為聚乙二 醇4000,聚乙二醇6000,聚乙二醇8000。試劑R2所選用的抗體為鼠抗人MPO單克隆抗體， 羊抗人MPO單克隆抗體，兔抗人MPO單克隆抗體一種或者幾種混合。也可以選鼠抗人MPO 多克隆抗體，羊抗人MPO多克隆抗體，兔抗人MPO多克隆抗體其中一種。試劑R2中的穩(wěn)定 劑選自小牛白蛋白，甘氨酸，明膠，吐溫20,曲拉通一種或者幾種。試劑R2為抗人MPO抗體 膠乳試劑，采用的是抗人的MPO抗體與膠乳顆粒相偶聯(lián)。經(jīng)過離心（過濾）的方法去掉未 反應(yīng)的偶聯(lián)劑以及未反應(yīng)的抗體，在含有穩(wěn)定劑和防腐劑的緩沖液中分散而成。所述抗人 MPO抗體的膠乳試劑的制備包括以下步驟。
[0016] 步驟1 :將膠乳在PH6. 5的溶液中活化。
[0017] 步驟2 :洗滌去掉溶液中的碳化二亞胺，加 PH7. 5-9. 0的緩沖液，加入MPO抗體，在 37度反應(yīng)4小時。
[0018] 步驟3 :將步驟2所得的液體用PH7. 5-9. 0的固定液固定6小時。
[0019] 步驟4 :將步驟3所得的液體用PH7. 5-9. 0的封閉液體封閉12小時。
[0020] 步驟5 :將步驟4所得的液體洗滌去掉未結(jié)合抗體，溶液用含有穩(wěn)定劑和防腐劑的 緩沖液洗滌分散即得。
[0021 ] 步驟1中所用的緩沖液為PBS緩沖液，MES緩沖液，碳酸鹽緩沖液中的任何一種緩 沖液，且濃度在20-100mmol/L，PH在5. 5-6. 5之間。
[0022] 步驟1中所用的膠乳可以是羧基化的聚苯乙烯膠乳或者是氨基化的聚苯乙烯膠 乳。其孔徑在60nm-150nm均可。
[0023] 步驟1中含有1-(3-二甲基氨基丙基）-3_乙基碳二亞胺、1-(3-二甲基氨基丙 基）-3-乙基碳二亞胺鹽或N-羥基硫代琥珀酰亞胺中的一種或者多種。
[0024] 在步驟2中，去掉溶液1中所含的未反應(yīng)的物質(zhì)，采用的是高速冷凍離心機(jī)或者超 微孔徑的過濾膜進(jìn)行過濾。
[0025] 在步驟5中，所用的穩(wěn)定劑是小牛血清白蛋白，明膠，甘氨酸，脫脂奶粉一種或者 幾種相混合。
[0026] 所述試劑盒還包括用于消除乳糜的試劑R3,所述試劑R3包含辛基甲氧基肉桂酸 酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂。
[0027] 優(yōu)化地，所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯20 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂100。
[0028] 對添加了不同乳糜單位濃度的血清樣本進(jìn)行對照測定，重復(fù)3遍，計(jì)算均偏差。偏 差范圍在±10%以內(nèi)視為無干擾，偏差范圍超過±10%視為干擾。
[0029] 表1未添加 R3試劑的的血清樣本結(jié)果
表2添加 R3試劑的的血清樣本結(jié)果
實(shí)施例2 與實(shí)施例1不同的是，所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂200。
[0030] 實(shí)施例3 與實(shí)施例1不同的是，所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯30 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚40 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂120。
[0031] 實(shí)施例4 與實(shí)施例1不同的是，所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯40 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚90 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂。
[0032] 實(shí)施例5 與實(shí)施例1不同的是，所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯20 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂100 乙酸丁酸纖維素20。
[0033] 實(shí)施例6 與實(shí)施例1不同的是，所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂200 乙酸丁酸纖維素80。
[0034] 實(shí)施例7 與實(shí)施例1不同的是，所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯30 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚40 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂130 乙酸丁酸纖維素30。
[0035] 實(shí)施例8 與實(shí)施例1不同的是，所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯40 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚80 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂170 乙酸丁酸纖維素70。
[0036] 實(shí)施例8 與實(shí)施例1不同的是，所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯20 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂100 羥甲基纖維素鈉20 乙酸丁酸纖維素20。
[0037] 實(shí)施例9 與實(shí)施例1不同的是，所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂200 羥甲基纖維素鈉100 乙酸丁酸纖維素80。
[0038] 實(shí)施例10 與實(shí)施例1不同的是，所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯25 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚35 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂110 羥甲基纖維素鈉25 乙酸丁酸纖維素30。
[0039] 實(shí)施例11 與實(shí)施例1不同的是，所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯45 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚90 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂180 羥甲基纖維素鈉80 乙酸丁酸纖維素60。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 髓過氧化物酶測定試劑盒，包含試劑Rl，R2以及校準(zhǔn)液；所述試劑Rl為pH值 7. 0-8. O的緩沖液，所述試劑R2為抗人MPO抗體膠乳試劑；所述校準(zhǔn)液為含有定量的MPO的 重組蛋白或者是從人血清中提取出來的天然MP0,其特征在于，所述試劑盒還包括用于消除 乳糜的試劑R3,所述試劑R3包含辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙 二醇-硫酸菊聚糖鎂。2. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的試劑盒，其特征在于所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯20-50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂100-200。3. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的試劑盒，其特征在于所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯20-50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂100-200 乙酸丁酸纖維素20-80。4. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的試劑盒，其特征在于所述試劑R3組分的重量份組成為： 辛基甲氧基肉桂酸酯20-50 聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚20-100 聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂100-200 羥甲基纖維素鈉20-100 乙酸丁酸纖維素20-80。
【專利摘要】髓過氧化物酶測定試劑盒，包含試劑R1，R2以及校準(zhǔn)液；所述試劑R1為pH值7.0-8.0的緩沖液，所述試劑R2為抗人MPO抗體膠乳試劑；所述校準(zhǔn)液為含有定量的MPO的重組蛋白或者是從人血清中提取出來的天然MPO，其特征在于，所述試劑盒還包括用于消除乳糜的試劑R3，所述試劑R3包含辛基甲氧基肉桂酸酯、聚氧丙烯聚氧乙烯丙二醇醚和聚乙二醇-硫酸菊聚糖鎂。本發(fā)明通過抗乳糜試劑R3的加入，使得乳糜干擾大為降低。
【IPC分類】G01N33/577
【公開號】CN105158473
【申請?zhí)枴緾N201510588749
【發(fā)明人】梁朝陽
【申請人】浙江凱成生物科技有限公司
【公開日】2015年12月16日
【申請日】2015年9月16日