一種微藻二氧化碳同化過程中的穩(wěn)定碳同位素分餾值的確定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種微藻二氧化碳同化過程中的穩(wěn)定碳同位素分餾值的確定方法，屬 于生態(tài)環(huán)境治理和海洋生物工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 微藻（microalgae)包括所有生活在水中營浮游生活方式的微小植物，通常就指 浮游藻類。微藻結(jié)構(gòu)簡單，其生理過程也相對簡單，有些種類是科學(xué)研究的模式植物，如：萊 茵衣藻、小球藻，很多種類還可以人工培養(yǎng)，這為我們的研究提供了便利。微藻對水體無機 碳的利用有兩種方式，（1)利用大氣中的二氧化碳。CO2作為線性非極性分子，呈電中性，它 可以自由擴散進入細胞雙層脂膜，進入細胞中的CO2為微藻細胞的光合作用所利用；（2)利 用溶液中碳酸氫根離子。碳酸氫根離子既可以直接轉(zhuǎn)運也可間接轉(zhuǎn)運到細胞中為微藻細胞 所利用。碳酸氫根離子的直接轉(zhuǎn)運指的是經(jīng)過細胞質(zhì)膜表面載體蛋白或陰離子交換蛋白， 直接把碳酸氫根離子轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)，在胞內(nèi)經(jīng)碳酸酐酶轉(zhuǎn)化為〇)2或直接以碳酸氫根離子 的形式由葉綠體膜蛋白主動運輸?shù)饺~綠體內(nèi)，經(jīng)碳酸酐酶轉(zhuǎn)化成〇)2供核酮糖-1，5-二磷 酸羧化/加氧酶（Rubisco)固定；碳酸氫根離子的間接轉(zhuǎn)運是指依賴于胞外碳酸酐酶的碳 酸氫根離子的間接轉(zhuǎn)運。碳酸酐酶（EC 4.2. I. 1)是一種含鋅的金屬酶，催化0)2與!10)3的 可逆轉(zhuǎn)化：C02+H20eH++HC03。碳酸酐酶分為質(zhì)膜內(nèi)和質(zhì)膜外兩種。質(zhì)膜外碳酸酐酶(又稱 胞外碳酸酐酶）通過金屬離子與細胞壁內(nèi)表面相連接，催化細胞擴散層中碳酸氫根離子迅 速水解成游離CO2，從而保證了細胞的OV決速供應(yīng)。
[0003] 有些藻類只利用CO2;有些藻類不僅能利用CO2，還能或直接利用碳酸氫根離子，或 通過胞外碳酸酐酶間接利用碳酸氫根離子，或者兩者兼而有之。微藻在二氧化碳同化成藻 體時碳會發(fā)生分餾，不同藻體因為大小結(jié)構(gòu)的差異，其穩(wěn)定碳同位素分餾值也明顯不同。 了解不同微藻在二氧化碳同化過程中的穩(wěn)定碳同位素分餾值，不僅對分析水體微藻的種群 結(jié)構(gòu)，定量微藻不同類型的碳匯，具有重要的意義。同時，也為海洋科學(xué)、湖泊科學(xué)以及水生 生物學(xué)提供了便利工具，為水華赤潮的治理提供科學(xué)依據(jù)?？墒?，目前還沒有一個獲取微藻 二氧化碳同化過程中的穩(wěn)定碳同位素分餾值的在體（in vivo)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，提供一種微藻二氧化碳同化過程中的穩(wěn)定碳同位素 分餾值的確定方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)通過設(shè)計多步體外反應(yīng)過程和步驟分析而無法在體確 定穩(wěn)定碳同位素分餾值的不足。
[0005] 本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：它包括以下步驟：第一，選擇兩種S13C值差值大 于10 %。的碳酸氫鈉作為同位素標記1和同位素標記2分別添加到檢測培養(yǎng)液中同時 在同樣的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)起始生物量相同的待測微藻；檢測培養(yǎng)液為添加碳酸氫鈉的濃 度為16mM及以上、同時附加 IOmM乙酰唑胺也即AZ的藻類培養(yǎng)液。測定待測微藻的起 始生物量Μ。和微藻的起始穩(wěn)定碳同位素組成δ 13C的值δ。。同位素標記1的碳酸氫鈉 的δ 13C值為δ "，同位素標記2的碳酸氫鈉的δ 13C值為δ ε2;第二，將待測微藻在添加 同位素標記的檢測培養(yǎng)液中培養(yǎng)4天后，測定待測微藻的最終生物量MjP在兩種同位素 標記的檢測培養(yǎng)液培養(yǎng)的被考察微藻的穩(wěn)定碳同位素組成S 13C的值Ssi和δ S2;第三， 利用雙向標記培養(yǎng)植物測定大氣二氧化碳穩(wěn)定碳同位素組成的方法，測定在培養(yǎng)期間每 天培養(yǎng)環(huán)境中大氣二氧化碳的日平均穩(wěn)定碳同位素組成，由此計算出在培養(yǎng)期間，培養(yǎng) 環(huán)境中大氣二氧化碳的平均穩(wěn)定碳同位素組成S 13C的值δ 第四，待測微藻增值倍 數(shù)Ρ=ΜΝ/Μ。;第五，將微藻的起始穩(wěn)定碳同位素組成δ。、待測微藻增值倍數(shù)P以及在兩種 同位素標記的檢測培養(yǎng)液培養(yǎng)的被考察微藻的穩(wěn)定碳同位素組成Ssi或δ S2代入方程：
，計算出在兩種同位素標記的檢測培養(yǎng)液培養(yǎng)的被 考察微藻的新生藻體穩(wěn)定碳同位素組成S 13C的值δ T1和δ T2;第六，將δ Τ1、δ Τ2、δ α和 S C2代入到方程：
，計算出待測微藻利用添加的無機碳源的份額fB;第七， 將 δair 以及 δ ^和 δ?；?δΤ2、δC2代入到方程： = δair+fBδ Cf δT1_fBδair 或暴=δalr+fB δ C2 - δ T2-fB δ _，計算出待測微藻二氧化碳同化過程中的穩(wěn)定碳同位素分餾值應(yīng)。
[0006] 本發(fā)明的優(yōu)點如下： 1) 本發(fā)明不僅能測得單個微藻種二氧化碳同化過程中的穩(wěn)定碳同位素分餾值，而且也 能測定混合藻體微藻二氧化碳同化過程中的穩(wěn)定碳同位素分餾值，有利于分析水體微藻的 種群結(jié)構(gòu)，定量微藻不同類型的碳匯，這是目前現(xiàn)有方法無法做到的； 2) 依據(jù)本發(fā)明測得的微藻二氧化碳同化過程中的穩(wěn)定碳同位素分餾值，可以直接應(yīng)用 到自然水體量化自然水體微藻無機碳利用途徑； 3) 本方法在完全相同的實驗條件下同時開展兩個培養(yǎng)實驗，因此，獲取微藻二氧化碳 同化過程中的穩(wěn)定碳同位素分餾值的數(shù)據(jù)更為可靠； 4) 本方法排除了老"碳"對測定結(jié)果的影響，因此，測定的結(jié)果精確度高； 5) 利用本方法測得的微藻二氧化碳同化過程中的穩(wěn)定碳同位素分餾值，可以反過來測 得不同環(huán)境的大氣二氧化碳的平均穩(wěn)定碳同位素組成δ 13C的值δ _。這為生態(tài)學(xué)研究以 及碳匯研究帶來了便利。
[0007] 發(fā)明原理 自然界中碳元素有兩種穩(wěn)定同位素：12c和13C，它們的天然平均豐度分別為98. 89%和 1. 11%。穩(wěn)定碳同位素組成通常用S 13C (%。)表示，自然界中δ 13C的變化為-90%。~+20%。。 質(zhì)量平衡原理以及同位素混合模型和化學(xué)計量學(xué)方法，是定量微藻二氧化碳同化過程中的 穩(wěn)定碳同位素分餾值的基礎(chǔ)。
[0008] 微藻兩種無機碳利用途徑造成的同位素分餾差異有明顯不同。利用大氣中的二氧 化碳途徑可造成最大的同位素分餾(_)。碳酸氫根離子的直接轉(zhuǎn)運和依賴于胞外碳酸酐酶 的碳酸氫根離子的間接轉(zhuǎn)運途徑造成的同位素分餾比利用大氣中的二氧化碳途徑造成同 位素分餾小9%。（PDB)。
[0009] 乙酰唑胺（acetazolamide，AZ)是含1，3，4-噻二挫環(huán)的雜環(huán)磺酰胺類碳酸酐酶 胞外酶抑制劑。利用碳酸酐酶胞外酶抑制劑能夠?qū)Ｒ坏匾种铺妓狒赴饷傅奶攸c，研究 碳酸酐酶胞外酶活性被抑制下的微藻同位素變化，可以反向識別依賴于胞外碳酸酐酶的碳 酸氫根離子的間接轉(zhuǎn)運途徑對無機碳利用的貢獻和份額。在依賴于胞外碳酸酐酶的碳酸氫 根離子間接轉(zhuǎn)運途徑被抑制同時，碳酸氫根離子的直接轉(zhuǎn)運途徑也同時被抑制。高濃度碳 酸氫鈉也對碳酸酐酶胞外酶有抑制作用，在高濃度碳酸氫鈉和IOmM AZ的作用下，依賴于胞 外碳酸酐酶的碳酸氫根離子的間接轉(zhuǎn)運途徑和碳酸氫根離子的直接轉(zhuǎn)運途徑將同時被完 全抑制。
[0010] 對于微藻來說，它們都可以利用大氣的無機碳源和添加的無機碳源，且對于每一 種來源的無機碳的利用，都存在〇)2和HCO 3兩種無機碳利用途徑，為此，我們可以建立如下 兩端元的同位素混合模型： δ Ti-(l_fBi) δ TA+fBi δ TB =(l-fBi) [ (l_fbi) ( 5air_ _ ) +fbi ( δ air- # +9%。）] +fBi [ (l_fbi) ( δ Ci- _ ) +fbi ( δ Ci- _ +9%0)](i=l, 2) (I) S TA是指微藻利用大氣來源的無機碳，包括：CO2和HC03_這兩種利用途徑；δ TB是指 微藻利用添加的碳酸氫鈉來源的無機碳，同樣包括：CO2和HC03_這兩種利用途徑。δ Τι為添加已知δ 13C的某一碳酸氫鈉培養(yǎng)的微藻藻體的δ 13C值，fBl為微藻利用添加的無機碳 占總碳源的份額，（I- fBl)為微藻利用大氣二氧化碳占總碳源的份額。fbl為微藻利用碳酸 氫根離子途徑，（l_fbl)為微藻二氧化碳利用途徑份額。S aii、Λ以及δ "分別為環(huán)境中大 氣二氧化碳的平均穩(wěn)定碳同位素組成S 13C的值、二氧化碳同化過程中的穩(wěn)定碳同位素分 餾值以及同位素標記的碳酸氫鈉的S 13C值。
[0011] 在同一條件下培養(yǎng)的同一種微藻，對于添加的兩種標記的重碳酸鹽來說，方程（1) 可以分別表示如下： 5T1=(l-fB1) [(l-fbl)(5air- . )+fbl(5air-:森 +9 %0 )]+fB1[(l-fbl) (5C1-:森 )+fbi ( δ C1-::泰+9%。）] (2) 5T2=(l-fB2) [ (l-fb2) ( δ air- # )+fb2(5air- 1； +9 %0 ) ]+fB2[ (l-fb2) ( δ C2- Ji )+fb2 ( ^ CL'- +9%0) ] (3) 在方程（2)和（3)中，δ T1為添加第一種已知δ 13C的碳酸氫鈉培養(yǎng)的微藻藻體的δ 13C 值；δ Τ2為添加第二種已知δ 13C的碳酸氫鈉培養(yǎng)的微藻藻體的δ 13C值；fB1為微藻利用添 加的第一種碳酸氫鈉占總碳源的份額；fB2為微藻利用添加的第二種碳酸氫鈉占總碳源的 份額；fbl為培養(yǎng)在添加第一種已知δ 13C的碳酸氫鈉的培養(yǎng)液中的微藻利用碳酸氫根離子 途徑所占的份額；fb2為培養(yǎng)在添加第二種已知δ 13C的碳酸氫鈉的培養(yǎng)液中的微藻利用碳 酸氫根離子途徑所占的份額。Sei為同位素標記1的碳酸氫鈉的δ 13C值，Se2為同位素標 記2的碳酸氫鈉的δ 13C值。
[0012] 基于以下兩點認識：1、不論添加哪種標記的碳酸氫鈉，只要在同一培養(yǎng)條件下，同 一種微藻利用添加的重碳酸鹽所占總碳源的份額是相同的，由此可以得到：fB1=fB2=f B。2、不 論添加哪種標記的碳酸氫鈉，只要在同一培養(yǎng)條件下，同一種微藻利用碳酸氫根離子途徑 所占的份額是相同的，由此可以得到：fbl=fb2=fb。在此基礎(chǔ)上，由方程（2)與方程（3)做差、 化簡可得： CN 105181820 A m "Ti 4/6 頁
由于在高濃度碳酸氫鈉和IOmM AZ的作用下，依賴于胞外碳酸酐酶的碳酸氫根離子的 間接轉(zhuǎn)運途徑和碳酸氫根離子的直接轉(zhuǎn)運途徑將同時被完全抑制，所以。
[0013] fbl=fb2=fb=〇 (5) 這樣，此時的（2)和（3)式可分別簡化成： 」=5air+ fB δ C1-δ T1-fB δ air (6) :逢:=5air+f