快速高靈敏同步定量檢測(cè)葉片總?cè)~酸及葉酸衍生物的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS)快速且高靈敏度同步檢測(cè) 植物葉片總?cè)~酸及七種葉酸衍生物含量的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 葉酸是一種具有重要營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的水溶性B族維生素，是指四氫葉酸及其衍生物這 一類物質(zhì)，它由蝶啶、對(duì)氨基苯甲酸和谷?；溄M成。作為一碳供體，葉酸參與嘌呤、嘧啶的 合成和氨基酸的相互轉(zhuǎn)化。人體缺少葉酸會(huì)導(dǎo)致一系列的慢性疾病，例如神經(jīng)管缺陷、先天 缺陷、巨紅血球性貧血、心血管疾病和癌癥等。然而，人類和哺乳動(dòng)物不能自行合成葉酸，只 能通過食物補(bǔ)充。但是，人們通過日常飲食攝入的葉酸含量低于健康標(biāo)準(zhǔn)（400 yg每天）， 因此，全球許多國(guó)家都在致力于通過生物強(qiáng)化的手段增加植物的葉酸含量，從而使人類可 通過日常飲食攝入更多的葉酸。蔬菜是人類主要的膳食，蔬菜葉酸的生物強(qiáng)化也是全球目 前研究熱點(diǎn)之一，然而蔬菜中葉酸的含量很低，并且含有多種不穩(wěn)定的衍生物，因此建立一 種高靈敏度、高效穩(wěn)定地檢測(cè)植物葉片中葉酸含量的方法非常必要。
[0003] 由于植物中葉酸有許多結(jié)構(gòu)類似物，并且不穩(wěn)定，因此分析植物葉片的葉酸含量 是一種挑戰(zhàn)，而葉酸的提取過程是關(guān)鍵。由于葉酸對(duì)光、氧化劑和PH都非常敏感，因此緩沖 液的pH和熱處理都會(huì)影響到葉酸的穩(wěn)定性。作物中葉酸主要以多谷氨酸鹽的形式存在，即 便是以單谷氨酸鹽形式存在，也常是多種衍生物共存，因此需用葉酸輒合酶達(dá)到去輒合作 用。葉酸輒合酶可用人類或大鼠的血清、豬腎臟和雞胰臟等，選擇適宜的葉酸輒合酶才能在 提取過程中充分發(fā)揮去輒合作用。
[0004] 目前測(cè)定葉酸的方法有微生物法，但其只能測(cè)定總?cè)~酸，不能區(qū)分葉酸衍生物，并 且實(shí)驗(yàn)操作繁瑣費(fèi)時(shí)。現(xiàn)在也有越來(lái)越多使用氣相色譜或液相色譜的方法測(cè)定植物和食物 中的葉酸，但是氣相色譜也不能區(qū)分不同的葉酸衍生物。不同的葉酸衍生物的生理功能各 不相同，因此有效地區(qū)分它們非常重要。液相色譜可以有效區(qū)分不同形式的葉酸衍生物，但 目前較多報(bào)道利用高效液相紫外檢測(cè)器法檢測(cè)組成單一、葉酸含量高的樣品，不適宜檢測(cè) 葉酸含量低的樣品，而且，此種方法檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，若批量檢測(cè)則葉酸容易在檢測(cè)過程中降 解，因此只能檢測(cè)少量樣品。所以，建立穩(wěn)定快速地提取植物葉片的葉酸并快速、高效、高靈 敏度、批量同步檢測(cè)植物葉片中葉酸含量及其不同葉酸衍生物含量的方法對(duì)植物生物強(qiáng)化 相關(guān)領(lǐng)域研究具有重要意義。
[0005] 2011100064527的發(fā)明《同步定量測(cè)定蔬菜中總?cè)~酸及其衍生物含量的方法》存在 著葉酸樣品準(zhǔn)備時(shí)間較長(zhǎng)、測(cè)量時(shí)間長(zhǎng)、同步只能檢測(cè)葉酸及四種葉酸衍生物的技術(shù)缺陷。 而本方法葉酸樣品準(zhǔn)備時(shí)間短、檢測(cè)時(shí)間只需5分鐘，可以同步定量檢測(cè)葉酸及七種葉酸 衍生物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS) 快速高靈敏度同步測(cè)定植物葉片總?cè)~酸及其衍生物含量的方法。應(yīng)用此種方法可以快速同 步測(cè)定植物葉片中總?cè)~酸及多種葉酸衍生物的含量。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供快速高靈敏同步定量檢測(cè)蔬菜中總?cè)~酸及其 衍生物含量的方法，依次包括以下步驟：
[0008] 1)、提取植物葉片中的葉酸及葉酸衍生物：
[0009] 利用0. 05M磷酸緩沖液煮沸提取植物葉片的葉酸，冷卻并離心后，得上清液，上清 液為葉酸提取物（包括葉酸及葉酸衍生物）；
[0010] 2)、添加兩種葉酸輒合酶
[0011] 往步驟1)中的葉酸提取物添加老鼠血清輒合酶和雞胰腺輒合酶，加入氬氣后 37°C孵育2小時(shí)，100°C水浴5分鐘終止酶活，離心后取上清液，上清液為葉酸去輒合提取 物；
[0012] 3)、使用超濾離心管純化植物葉片葉酸去輒合提取物
[0013] 使用IOkDa 500 yL超濾離心管（Millipore，美國(guó)），活化后，往里加入500 yL步 驟2)得的葉酸去輒合提取物，12000g 4°C離心15分鐘，得到純化后的葉酸純化液（為過柱 后所得的溶液）；
[0014] 4)、超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分離葉酸衍生物質(zhì)譜方法
[0015] 超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)系統(tǒng)為四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（Waters Xevo TQ-S, Waters,美國(guó)）常壓電噴霧電離（ESI)正極模式。Waters IntelliStart Technology通過自動(dòng)和手動(dòng)優(yōu)化所有葉酸衍生物的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring, MRM)。每一種葉酸衍生物使用兩個(gè)或三個(gè)子離子確定，結(jié)果如表1。MassLynx 4. I (Waters，美國(guó)）軟件用于系統(tǒng)運(yùn)行、數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析。
[0016] 表1葉酸及葉酸衍生物的多離子反應(yīng)檢測(cè)和化合物指標(biāo)
CN 105181829 A 說明書 3/15 頁(yè)
[0019] 5)、超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分離葉酸衍生物色譜方法
[0020] 使用Waters ACQUITY UPLC系統(tǒng)（Waters，美國(guó)）進(jìn)行葉酸衍生物的色譜分離，運(yùn) 行軟件為TargetLynx 4. I (Waters，美國(guó)）。柱溫箱維持40°C，自動(dòng)進(jìn)樣器維持4°C。色譜柱 是八0〇1]打￥皿1^：8^1，(：18(3〇11111111，規(guī)格為2.111111^5〇111111，粒徑1.7 4111(^丨618，美國(guó)）連接一 個(gè) VanGuard前置柱 C18,規(guī)格為 5_X 2. 1mm,粒徑 I. 8 μ m(Waters，美國(guó)）。流速0· 4mL/min ； 進(jìn)樣量2yL，運(yùn)行時(shí)間5分鐘。流動(dòng)相為洗脫液A(0. 1%甲酸溶于水）和洗脫液B(0. 1%甲 酸溶于乙腈）梯度洗脫，詳見表2。針頭清洗溶劑為乙腈/水混合液（50/50, v/v);
[0021] 表2 UPLC-MS/MS最佳梯度洗脫
[0024] 6)、植物葉片葉酸衍生物的定量測(cè)定。
[0025] 作為本發(fā)明高效高靈敏同步定量檢測(cè)植物葉片總?cè)~酸及其衍生物的方法的改進(jìn)： 步驟1)中的0. 05M磷酸緩沖液濃度為每升加入IOg L(+)-抗壞血酸和IOml二巰基丙醇的 磷酸緩沖液。
[0026] 作為本發(fā)明高效高靈敏同步定量測(cè)量植物葉片總?cè)~酸及其衍生物的方法的進(jìn)一 步改進(jìn)：所述步驟2)中在每IOmL葉酸提取物中加入2mL雞胰腺輒合酶，搖勻后，吸取3mL溶 液于50mL離心管中，加入100 μ L老鼠血清輒合酶，搖勻，充入氬氣，37°C孵育2小時(shí)，100°C 水浴5分鐘終止酶活。
[0027] 作為本發(fā)明高效高靈敏同步定量檢測(cè)植物葉片總?cè)~酸及其衍生物的方法的進(jìn)一 步改進(jìn)：所述步驟6)為：根據(jù)步驟4)和步驟5)的條件，對(duì)植物葉片葉酸及其衍生物進(jìn)行 定量測(cè)定，記錄主峰峰面積，按照外標(biāo)法以峰面積自動(dòng)計(jì)算得出四氫葉酸、5-甲基-四氫葉 酸、5-甲酰-四氫葉酸、5, 10-次甲基四氫葉酸、10-甲酰-葉酸、10-甲酰-四氫葉酸、葉酸 的含量，再根據(jù)四氫葉酸、5-甲基-四氫葉酸、5-甲酰-四氫葉酸、5, 10-次甲基四氫葉酸、 10-甲酰-葉酸、10-甲酰-四氫葉酸、葉酸的濃度和相對(duì)分子質(zhì)量計(jì)算總?cè)~酸含量。
[0028] 本發(fā)明的方法包括以下：(A)提供一種磷酸緩沖液煮沸提取植物葉片中葉酸的方 法；(B)提供兩種葉酸輒合酶混合使用的方法；(C)提供一種超濾離心管純化植物葉片葉酸 提取物的方法；(D)提供一種檢測(cè)系統(tǒng)為四極桿串聯(lián)質(zhì)譜（Waters Xevo TQ-S，Waters，美 國(guó)）常壓電噴霧電離（ESI)正極模式的質(zhì)譜分離植物葉片中各種葉酸衍生物的方法；(E) 提供一種色譜柱分離植物葉片中各種葉酸衍生物的方法；(F)提供一種用超高效液相色 譜-串聯(lián)質(zhì)譜高效高靈敏度同步測(cè)定植物葉片中不同葉酸衍生物的方法。
[0029] 本發(fā)明的植物葉片中不同葉酸及其衍生物含量測(cè)定方法，具有以下特點(diǎn)：
[0030] (1)同時(shí)添加老鼠血清輒合酶與雞胰腺輒合酶，預(yù)防葉酸的氧化破壞，提高去輒合 效率。
[0031] (2)本發(fā)明中，使用規(guī)格500 μ LlOkDa超濾離心管純化葉酸提取物，離心機(jī)一次可 以離心30個(gè)樣品，既能有效過濾雜質(zhì)，又大大加快了提取速度，減少葉酸及其衍生物在提 取過程中的降解。
[0032] (3)ACQUITY UPLC ΒΗ1，C18C0Iumn色譜柱結(jié)合超高效液相色譜四極桿串聯(lián)質(zhì)譜 (UPLC-MS/MS) (Waters Xevo TQ-S，Waters,美國(guó)）結(jié)合常壓電噴霧電離（ESI)正極模式可 以同時(shí)分離和定量測(cè)定植物葉片七種葉酸衍生物，并且只需5分鐘即可檢測(cè)完畢，進(jìn)樣量 只需2 μ L，檢測(cè)方法高效靈敏，可批量檢測(cè)樣品。
[0033] 本發(fā)明植物葉片中不同葉酸及其衍生物含量測(cè)定方法，具有以下有益效果：
[0034] (1)本發(fā)明靈敏度高、快速高效，可批量同步檢測(cè)成分復(fù)雜，低葉酸含量的植物葉 片的葉酸及其衍生物含量的測(cè)定。
[0035] (2)本發(fā)明可以分離植物葉片中的七種葉酸衍生物，并可以定量分析總?cè)~酸及七 種葉酸衍生物含量。
【附圖說明】
[0036] 下面結(jié)合附圖對(duì)本方法【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0037] 圖1是不同葉酸衍生物的結(jié)構(gòu)圖；
[0038] 圖2是UPLC-MS/MS測(cè)定不同形式葉酸衍生物的色譜圖。所用樣品為市場(chǎng)購(gòu)得的 小白菜，按照本方法制得葉酸提取物，但在步驟1)添加〇. 05M磷酸緩沖液同時(shí)添加混合標(biāo) 樣（混合標(biāo)樣為七種葉酸衍生物標(biāo)準(zhǔn)品的混合物，每種衍生物添加量為〇. 5 μ g/100g)。樣 品按照本方法的條件進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)樣量為2 μ 1，檢測(cè)時(shí)間5分鐘。10-CH0-THF，10-甲酰-四 氫葉酸；5-CH0-THF，5-甲酰-四氫葉酸；10-CH0-FA，10-甲酰-葉酸；M-T