一種量子點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌定量檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種醫(yī)療檢驗檢測方法，尤其是涉及一種量子點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌定量檢測試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]結(jié)核病以呼吸道傳播為主，也可以通過消化道、破損皮膚粘膜等多種途徑進(jìn)入機(jī)體，侵犯多種組織器官，以肺結(jié)核最為常見，其致病性可能與細(xì)菌在組細(xì)胞內(nèi)大量繁殖引起的炎癥、菌體成分及代謝物質(zhì)的毒性以及機(jī)體對菌體成分生的免疫損傷有關(guān)。
[0003]MTB致病菌體成分包括脂類(抗吞噬、抗消毀)、蛋白質(zhì)(與蠟質(zhì)、磷脂結(jié)引起機(jī)體遲發(fā)型過敏反應(yīng))、多糖質(zhì)(與脂質(zhì)結(jié)合成脂多糖，能引起機(jī)體發(fā)生速發(fā)型過敏反應(yīng)，又能引起局部病灶內(nèi)細(xì)胞浸潤和抑制抗原與抗體的反應(yīng))。
[0004]結(jié)核病患者的抗體反應(yīng)是針對結(jié)核抗原的，任何一種抗原都無法檢測結(jié)核病患者血清中所有的結(jié)核抗體，因此聯(lián)合多種抗原進(jìn)行檢測，在保證特異性的基礎(chǔ)上有助于提高診斷的敏感性。目前檢測方法中，主要是通過ELISA等免疫學(xué)檢測，檢測結(jié)果不夠準(zhǔn)確，檢測不夠迅速，存在漏檢的風(fēng)險，檢測過程用時間久，極為不方便。
[0005]尤其是現(xiàn)有的檢測沒有對血液中存在相應(yīng)的抗體，作相對定量的檢測，且現(xiàn)有的檢測方法也無法對抗體的進(jìn)行相對定量，不能很好的對結(jié)核病進(jìn)行診斷和治療，不能很好的對結(jié)核病感染進(jìn)行分期，更準(zhǔn)確的判斷結(jié)核的感染、發(fā)生以及發(fā)展，為臨床用藥提供更加準(zhǔn)確的指導(dǎo)。
[0006]篩選多個純化特異性抗原組成的聯(lián)合抗原來檢測結(jié)核病患者體內(nèi)抗體，增加血清學(xué)診斷的敏感性，是目前結(jié)核病血清學(xué)診斷研究中的主要方向。本檢測是通過聯(lián)合多個純化結(jié)核特異性抗原，利用雙抗原夾心法檢測血清中的相應(yīng)抗原的特異性抗體(IgG，IgM等)，已達(dá)到檢測的靈敏度和特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種量子點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌定量檢測試劑盒，其具有檢測結(jié)果準(zhǔn)確，特異性好，靈敏度高，可以對檢測的抗體相對定量避免結(jié)核的漏檢，測量的結(jié)果穩(wěn)定可靠。
[0008]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種量子點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌定量檢測試劑盒，其包括:弱熒光層析膜、弱熒光吸水紙、弱熒光盒體、弱熒光上樣墊、弱熒光支撐墊板、弱熒光標(biāo)記墊以及緩沖液；
其中，所述弱熒光標(biāo)記墊上設(shè)有量子點(diǎn)標(biāo)記的MPT32、38KD、MPT 63以及CFP10-ESAT 6蛋白；
所述弱熒光吸盒體分為上蓋體和底座，所述上蓋體上設(shè)置有第一加樣孔、第二加樣孔以及檢測窗口；
所述量子點(diǎn)標(biāo)記的MPT32、38KD、MPT 63以及CFP10-ESAT 6蛋白以質(zhì)量比為4:3:5:5比例混合后，與弱焚光標(biāo)記墊結(jié)合；
弱熒光上樣墊部分與所述弱熒光標(biāo)記墊疊合，所述弱熒光標(biāo)記墊部分與弱熒光層析膜2的一端疊合，所述弱熒光吸水紙與所述弱熒光層析膜2的另一端疊合，所述弱熒光層析膜
2、所述弱熒光標(biāo)記墊以及所述弱熒光上樣墊與所述弱熒光支撐墊板結(jié)合；
所述緩沖液中含有熒光猝滅劑，該熒光猝滅劑可使弱熒光吸水紙上的弱熒光進(jìn)一步消失，但不影響量子點(diǎn)標(biāo)記的蛋白；
所述弱熒光層析膜上依次包被有第一檢測帶MPT32蛋白、第二檢測帶38KD蛋白、第三檢測帶MPT 63蛋白以及第四檢測帶CFP10-ESAT 6蛋白以及質(zhì)控帶；
所述緩沖液中疊氮鈉的質(zhì)量濃度為0.001%，PVC的質(zhì)量濃度為0.01%以及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的海藻糖，PEG的質(zhì)量濃度為0.005% ;
所述弱熒光盒體的一側(cè)設(shè)置有空隙，利于液體在層析墊上虹吸作用的發(fā)生。
[0009]所述量子點(diǎn)是ZnS、CdSe, MgSe, CdTe的量子點(diǎn)的之一或者至少其中兩者的組合，且其中摻雜有Cu、Mn、Fe和Hg中的至少一種。
[0010]所述量子點(diǎn)為CdSe/ZnS。
[0011 ] 所述緩沖液的pH值為7.8-8.6之間，且所述緩沖液的pH值是通過碳酸鈉溶液或者氨水溶液進(jìn)行調(diào)整的。
[0012]所述量子點(diǎn)標(biāo)記的MPT32、38KD、MPT 63以及CFP10-ESAT 6蛋白，通過質(zhì)量濃度為1%至2%的BSA對其進(jìn)行封閉。
[0013]所述量子點(diǎn)標(biāo)記的MPT32、38KD、MPT 63以及CFP10-ESAT 6蛋白的熒光發(fā)射波長為 580_630nm。
[0014]所述質(zhì)控帶上包被有多克隆抗體。
[0015]MPT32蛋白的最佳標(biāo)記量為0.5ug/pmol量子點(diǎn)；
38KD蛋白的最佳標(biāo)記量為0.6ug/pmol量子點(diǎn)；
MPT 63蛋白的最佳標(biāo)記量為0.7ug/pmol量子點(diǎn)；
CFP1-ESAT 6的最佳標(biāo)記量為0.5ug/pmol量子點(diǎn)。
[0016]還包括熒光定量檢測儀，用于判讀檢測條帶和質(zhì)控條帶的熒光檢測強(qiáng)度。
[0017]所述熒光定量檢測儀包含激發(fā)光源模塊、濾光模塊、光電轉(zhuǎn)換模塊、控制分析模塊和軟件系統(tǒng)。
[0018]本發(fā)明的量子點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌定量檢測試劑盒，由于采用了本發(fā)明的緩沖液的配方，使得減少了試劑盒檢測的非特異性結(jié)合，提高了靈敏度和準(zhǔn)確度，并且通過量子點(diǎn)標(biāo)記蛋白，可以對抗體檢測進(jìn)行相對定量，提高了檢測的精確度，多個蛋白的聯(lián)合運(yùn)用進(jìn)行檢測，避免了對結(jié)核感病者的漏檢，本發(fā)明采用了弱熒光性的試劑盒、層析膜、吸水紙以及本發(fā)明的緩沖液，尤其是緩沖液中加入了熒光淬滅劑降低了背景信號信噪比，提高了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度。
[0019]
【附圖說明】
[0020]圖1本發(fā)明的量子點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌定量檢測試劑盒的正面結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2為本發(fā)明的量子點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌定量檢測試劑盒的內(nèi)部試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖3為本發(fā)明的量子點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌定量檢測試劑盒的試紙條的縱截面結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實施方式】
[0021]下面通過具體的實施例進(jìn)一步對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行說明，但不是對本發(fā)明的限制，任何人根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，而對本發(fā)明作出的簡單的修改、等同替換皆屬于本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0022]結(jié)核分枝桿菌的多個抗原可用于結(jié)核的體外檢測，每個抗原具體應(yīng)用到體外檢測的過程中，其實際操作過程存在一定的難度，例如會存在交叉反應(yīng)，不同蛋白之間，在檢測標(biāo)記過程中，存在著相互之間的影響，例如，將38KD蛋白與TB-SA蛋白通過量子點(diǎn)標(biāo)記時，共同檢測時，兩者相互影響，影響檢測的結(jié)果。
[0023]經(jīng)過無數(shù)次的檢測實驗，選擇所需要的結(jié)核檢測蛋白，并進(jìn)行量子點(diǎn)標(biāo)記，通過樣本進(jìn)行檢測，通過與質(zhì)控品比較，得到適合混合一起檢測的結(jié)核分枝桿菌蛋白。通過分析以及實驗篩選，選擇檢測蛋白之間無相互影響，檢測結(jié)果準(zhǔn)確，特異性高，靈敏度高的抗原聯(lián)合對結(jié)核分支桿菌進(jìn)行檢測。
[0024]本發(fā)明選擇的結(jié)核分支桿菌蛋白為:MPT32、38kDa、MPT 63以及CFP10-ESAT6。具體的，本發(fā)明的MPT32抗原是一種糖基化纖連蛋白，屬于早期分泌蛋白，對結(jié)核病的早期診斷具有較高的陽性檢出率，可以很好的提高結(jié)核病的早期診斷率。38kDa蛋白是一定位在質(zhì)膜上的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，只在分枝桿菌復(fù)合體中表達(dá)，是結(jié)核分枝桿菌的一種分泌性脂蛋白，含有特異的B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞抗原決定簇，對小鼠、豚鼠和人類B細(xì)胞具有最強(qiáng)免疫學(xué)活性，能誘導(dǎo)早期反應(yīng)。38 kDa抗原參與磷酸鹽代謝的細(xì)胞外脂蛋白，對結(jié)核分枝桿菌抗體包括復(fù)雜菌種型均敏感特異。
MPT 63蛋白基因的Rv N0.為Rvl926c，其能以可溶性蛋白表達(dá)，ELISA方法應(yīng)用MPT63檢測血清抗體的敏感性和特異性分別為15%和98.7%，提示聯(lián)合抗原。陽性率8.41%;并以其為抗原ELISA法檢測涂陰和涂陽病人及對照組血清中IgG、IgA和IgM水平。
[0025]血清結(jié)核抗原的陽性檢出率均不高，但特異度很好。重組蛋白能與結(jié)核患者血清發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，與健康者血清不發(fā)生反應(yīng)。再以此蛋白免疫動物可產(chǎn)生高效價的抗體?？笴FP10-ESAT6多克隆抗體的效價在1:16000稀釋后0D450值基本上都達(dá)到1.0左右。在純化和酶標(biāo)記后，分別以1:1000為包被工作濃度，1:3000為酶標(biāo)工作濃度時，CFP10-ESAT6的最低檢出濃度為25ng / ml, CFP10-ESAT6檢測17種分枝桿菌培養(yǎng)上清只有結(jié)核分枝桿菌和牛結(jié)核分枝桿菌結(jié)果為陽性。在與血清反應(yīng)時的敏感性和特異性分別為40.1%，99.
[0026]本發(fā)明采用的抗原含有4種特異性抗原，故能測出IgG、IgM、IgA等不同抗體，提高了檢測敏感性，彌補(bǔ)了宿主體液免疫反應(yīng)的差異，應(yīng)用這種方法對結(jié)核病的診斷價值進(jìn)行探討，提示其具有較高特異性，能快速檢測結(jié)核抗體，對結(jié)核病的診斷及鑒別診斷具有較好臨床價值，且操作簡單、快速，適用于各級醫(yī)院，尤其適用于對門診患者做出快速診斷，該蛋白有兩個特意的B細(xì)胞表位。本發(fā)明利用四種抗原聯(lián)合檢測的靈敏度，特異度各自為 93%、98%。
[0027]此外，本發(fā)明，通過標(biāo)定某種抗原對應(yīng)的抗體的量，進(jìn)一步與病人的病程相對應(yīng)，以進(jìn)一步將抗體的檢測定量化，進(jìn)一步提高疾病診斷的準(zhǔn)確性。
[0028]本發(fā)明一種量子點(diǎn)結(jié)核分枝桿菌定量檢測試劑盒，其包括:弱熒光層析膜2、弱熒光吸水紙23、弱熒光盒體1、弱熒光上樣墊21、弱熒光支撐墊板10、弱熒光標(biāo)記墊22以及緩沖液；其中，弱熒光標(biāo)記墊22上設(shè)有量子點(diǎn)標(biāo)記的MPT32、38KD、MPT 63以及CFP10-ESAT 6蛋白；弱熒光吸盒體I分為上蓋體和底座