一種通過測(cè)定IVF培養(yǎng)液中β-hCG濃度預(yù)測(cè)胚胎活力的方法
【專利說明】
所屬技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及輔助生殖醫(yī)學(xué)體外受精-胚胎移植(IVF-ET)領(lǐng)域，尤其是在非侵入性胚胎質(zhì)量評(píng)價(jià)及挑選部分。
【背景技術(shù)】
[0002]經(jīng)過三十余年的努力，輔助生殖技術(shù)(assisted reproduct1n technique, ART)已經(jīng)取得了多個(gè)重大突破，促排卵治療、體外受精和胚胎培養(yǎng)技術(shù)均獲得了較完善的發(fā)展。然而胚胎種植率還沒有得到足夠的改善。為獲得高妊娠率采用多個(gè)胚胎移植及其帶來的多胎妊娠率和妊娠期母嬰并發(fā)癥的高發(fā)現(xiàn)象依然普遍存在，嚴(yán)重影響了體外受精-胚胎移植治療(in vitro fertilizat1n-embryo transfer, IVF-ET)的有效率和安全性。因此，在IVF-ET中，如何有效地選擇最有活力的胚胎進(jìn)行移植從而在穩(wěn)定妊娠率的基礎(chǔ)上降低多胎率已成為當(dāng)今全世界范圍ART的熱點(diǎn)問題。
[0003]近年來隨著生物學(xué)標(biāo)記物檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，如何從胚胎發(fā)育過程中尋找其特定的生物標(biāo)記，從而客觀地評(píng)價(jià)胚胎發(fā)育和種植潛能已成為生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域基礎(chǔ)應(yīng)用研究的重大挑戰(zhàn)。人絨毛膜促性腺激素(human chor1nic gonadotropin, hCG)是一種早期胚胎滋養(yǎng)球細(xì)胞和胎盤滋養(yǎng)層合體細(xì)胞分泌的，由α亞基及特異性β亞基以非共價(jià)鍵結(jié)合的糖蛋白激素。1984年Fishel SB and Edwards RGtn首先采用放射免疫法測(cè)定發(fā)現(xiàn)人類囊胚培養(yǎng)液中存在微量可測(cè)定的β _hCG，其分泌量隨囊胚擴(kuò)張和孵出快速增加，但該方法測(cè)定耗時(shí)長(zhǎng)且有放射污染。2011年Ramu等[2]報(bào)道的酶聯(lián)免疫測(cè)定法靈敏度達(dá)到0.1OOmlU/ml，但需要大量標(biāo)本同時(shí)測(cè)定，且測(cè)定花費(fèi)時(shí)間約2天，不能滿足IVF臨床實(shí)驗(yàn)室篩選胚胎方法的要求。因此，如何開發(fā)客觀、精確、快速和簡(jiǎn)單、方便、低成本的培養(yǎng)液中hCG檢測(cè)方法已成為當(dāng)前亟需解決的困難。
[0004]參考文獻(xiàn):
[0005]1.Fishel SB，Edwards RG，Evans CJ.Human chor1nic gonadotropin secretedby preimplantat1n embryos cultured in vitr0.Science.1984 ；223:816-8.
[0006]2.Sivakumar Ramu, Ph.D，Brian Acac1，M.D.，Mark Adamowiczj et al.Humanchor1nic gonadotropin from day2spent embryo culture media and its relat1nshipto embryo development Fertil&Steril.2011Sep ；96(3):615-617.
【附圖說明】
[0007]無
【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]為了克服現(xiàn)有的胚胎體外培養(yǎng)液中β-hCG測(cè)定方法耗時(shí)長(zhǎng)、樣本需成批非自動(dòng)化操作、具有放射污染，不能滿足IVF臨床篩選胚胎技術(shù)的要求，本發(fā)明提供一種改良的電化學(xué)發(fā)光免疫法，該方法不僅靈敏度高(0.100mlU/ml)、特異性高(回歸系數(shù)=0.989)、自動(dòng)化測(cè)定、無污染、重復(fù)性及再現(xiàn)性好，而且每份標(biāo)本測(cè)定時(shí)間為20分鐘左右。經(jīng)過大樣本的回顧性分析證實(shí)胚胎培養(yǎng)液β -hCG水平與胚胎發(fā)育及種植潛能呈高度正相關(guān)，具備作為胚胎生物標(biāo)記物應(yīng)用于臨床開展選擇性胚胎移植的要求。本發(fā)明能幫助預(yù)測(cè)胚胎活力，前瞻性選擇具有種植潛力的胚胎移植、在穩(wěn)定妊娠率的基礎(chǔ)上減少移植胚胎數(shù)目降低多胎妊娠。
【具體實(shí)施方式】
[0009]在此申請(qǐng)專利的方法包括步驟:提供胚胎體外培養(yǎng)后剩余的培養(yǎng)液標(biāo)本；新鮮或凍存在-80°C中；采用改良電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定所述培養(yǎng)液中β_人絨毛膜促性腺激素(β -hCG)水平；基于β -hCG水平預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育和種植潛能；選擇分泌高水平β -hCG的胚胎進(jìn)行移植。
[0010]1.胚胎培養(yǎng)
[0011]①能夠使用本發(fā)明方法評(píng)估的人類胚胎可以通過任何現(xiàn)有已知技術(shù)的方法產(chǎn)生。
[0012]②在一些實(shí)施方案中，胚胎由卵母細(xì)胞常規(guī)體外受精(IVF)形成的受精卵發(fā)育而成。在IVF中，通常將卵母細(xì)胞置于精液(濃度為5000-10000條精子/卵細(xì)胞)中，使其發(fā)生體外受精。受精后16-18小時(shí)觀察原核情況，將正常受精(雙原核)的胚胎置于適用于卵裂期胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的培養(yǎng)液中。受精后第3天觀察胚胎情況，再將其轉(zhuǎn)移至適用于囊胚期胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的培養(yǎng)液中?？蛇x擇第3天胚胎或囊胚移植到女性子宮腔內(nèi)。
[0013]③在一些實(shí)施方案中，胚胎由單精子卵母細(xì)胞漿內(nèi)注射(ICSI)形成的受精卵發(fā)育而成。ICSI常用于男性因素不育(如嚴(yán)重少弱畸精癥、無精癥)和受精失敗患者，在顯微鏡下將單條精子注入卵母細(xì)胞胞漿中。受精后16-18小時(shí)觀察原核情況，將正常受精(雙原核)的胚胎置于適用于卵裂期胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的培養(yǎng)液中。受精后第3天觀察胚胎情況，再將其轉(zhuǎn)移至適用于囊胚期胚胎生長(zhǎng)發(fā)育的培養(yǎng)液中?？蛇x擇第3天胚胎或囊胚移植到女性子宮腔內(nèi)。
[0014]④在一些實(shí)施方案中,囊胚由解凍卵裂期胚胎繼續(xù)培養(yǎng)發(fā)育而成。
[0015]⑤用于體外培養(yǎng)培養(yǎng)胚胎的各種培養(yǎng)液可通過商業(yè)途徑獲得，如Quinn’ s SageCleavage and Blastocyst Media，Vitrolife Gl.5and G2.5，Cook Sydney IVF Media，Global IVF media，Medicult ISM1&2。
[0016]⑥胚胎通常在合適的培養(yǎng)皿或試管中培養(yǎng)，其可由玻璃和/或聚苯乙烯合成。
[0017]⑦在一些實(shí)施方案中，胚胎在相對(duì)固定體積的培養(yǎng)液微滴中培養(yǎng)，并常用礦物油覆蓋微滴以減少培養(yǎng)過程中微滴的蒸發(fā)和使胚胎與外界環(huán)境隔絕。
[0018]⑧在一些實(shí)施方案中,每個(gè)培養(yǎng)液微滴可培養(yǎng)一個(gè)和/或多個(gè)胚胎。
[0019]2.β-hCG 測(cè)定
[0020]①本發(fā)明描述改良電化學(xué)發(fā)光法的特定應(yīng)用，胚胎培養(yǎng)液中β -hCG水平可用于預(yù)測(cè)胚胎種植和臨床妊娠的可能性和可行性。
[0021]②在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)液標(biāo)本可在新鮮和/或_8(TC冷凍保存凍融后再進(jìn)行分析。
[0022]③在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)液標(biāo)本需按比例稀釋后再進(jìn)行分析檢測(cè)(I: I或1:2)。
[0023]④在一些實(shí)施方案中，β -hCG水平通過具體數(shù)值體現(xiàn)，胚胎發(fā)育和種植潛能用β -hCG某一閾值進(jìn)行評(píng)估。
[0024]⑤在一些實(shí)施方案中，需用未培養(yǎng)過胚胎的同批號(hào)培養(yǎng)液(添加和未添加蛋白或蛋白類似物)進(jìn)行空白對(duì)照以及質(zhì)量控制。
[0025]⑥在一些實(shí)施方案中，可結(jié)合培養(yǎng)液β-hCG水平和胚胎的形態(tài)學(xué)評(píng)分挑選移植胚胎。
[0026]⑦用于改良電化學(xué)發(fā)光免疫法的各種設(shè)備、試劑及耗材可通過商業(yè)途徑獲得，如Hoffmann-La Roche Ltd。
[0027]胚胎移植
[0028]①在一些實(shí)施方案中，為了避免多胎妊娠，移植到子宮腔內(nèi)的胚胎數(shù)目可以受到限制。
[0029]②在一些實(shí)施方案中，移植胚胎可以是新鮮、凍融胚胎或凍融后卵裂期胚胎繼續(xù)培養(yǎng)的囊胚。
[0030]3.妊娠結(jié)局
[0031 ] ①妊娠結(jié)局作為評(píng)估胚胎種植潛能的標(biāo)志。
[0032]②妊娠可由已知的現(xiàn)有技術(shù)進(jìn)行評(píng)估。如移植胚胎兩周后，通過測(cè)定血液或尿液中hCG判斷生化妊娠的可能。移植胚胎后5-6周，通過超聲下觀察孕囊、胚芽和胎心搏動(dòng)來確定是否臨床妊娠。
[0033]③在一些實(shí)施方案中，妊娠結(jié)局的判讀可延長(zhǎng)至胎兒某個(gè)階段的發(fā)育，如孕早期(孕12周前)、孕中期(孕13周至孕27周)及孕晚期(孕28周后)的胎兒情況。
[0034]④在一些實(shí)施方案中，結(jié)局可追蹤至新生兒出生情況。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種方法，包括以下步驟: 提供胚胎體外培養(yǎng)液； 新鮮或凍存在-80°C中； 測(cè)定所述培養(yǎng)液標(biāo)本中β_人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)； 基于培養(yǎng)液β -hCG水平評(píng)估胚胎發(fā)育和種植潛能。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胚胎是由卵母細(xì)胞常規(guī)體外受精(IVF)形成的受精卵發(fā)育而成。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胚胎是由單精子卵母細(xì)胞漿內(nèi)注射(ICSI)形成的受精卵發(fā)育而成。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胚胎是經(jīng)胚胎活檢行植入前遺傳診斷后發(fā)育??? 。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述胚胎是人類胚胎。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，包括移植所述胚胎到人類子宮腔內(nèi)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述胚胎包括卵裂期和囊胚階段被移植。8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述種植潛能判定標(biāo)準(zhǔn)包括生化妊娠和臨床妊娠。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述早期妊娠包括所屬胚胎發(fā)育到孕12周。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述中期妊娠包括所屬胚胎發(fā)育到孕13-27周。11.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述晚期妊娠包括所屬胚胎發(fā)育到孕28-42周。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述測(cè)定步驟包括:對(duì)所述培養(yǎng)液標(biāo)本進(jìn)行改良電化學(xué)發(fā)光免疫法進(jìn)行測(cè)定。
【專利摘要】一種通過檢測(cè)人胚胎體外培養(yǎng)液中β-hCG水平預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育和種植潛能的方法，包括步驟：提供胚胎體外培養(yǎng)后剩余的培養(yǎng)液標(biāo)本；新鮮或凍存在-80℃中；采用改良電化學(xué)發(fā)光法測(cè)定所述培養(yǎng)液中β-人絨毛膜促性腺激素(β-hCG)水平；基于β-hCG水平預(yù)測(cè)胚胎發(fā)育和種植潛能；選擇分泌高水平β-hCG的胚胎進(jìn)行移植。
【IPC分類】G01N33/76
【公開號(hào)】CN105203776
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201410227658
【發(fā)明人】李潔, 陳曉燕, 莊廣倫, 姜儻, 張式鴻
【申請(qǐng)人】李潔
【公開日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2014年5月26日