一種近紅外磷光銥配合物的合成及其熒光檢測成像應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于氨基酸檢測領(lǐng)域，更具體地，本發(fā)明涉及一種磷光銥配合物的合成及 其用于含巰基的半胱氨酸和高半胱氨酸的檢測，該種磷光銥配合物具有檢測半胱氨酸和高 半胱氨酸的有益效果。
【背景技術(shù)】
[0002] 半胱氨酸（Cys)和高半胱氨酸（Hcy)是含巰基的氨基酸，屬于人體中的硫醇，能夠 平衡生物體內(nèi)的氧化還原反應(yīng)，體內(nèi)半胱氨酸和高半胱氨酸的含量與人體身體健康狀況緊 密相關(guān)。研究表明，半胱氨酸含量高低會影響人體生長速度，造成水腫、肝損傷等疾病。高 半胱氨酸在新陳代謝和內(nèi)穩(wěn)態(tài)過程中扮演非常重要的角色。Hcy與人類的心血管疾病、進行 性老年癡呆癥有直接關(guān)聯(lián)，血清內(nèi)高半胱氨酸的高水平是心血管疾病的風(fēng)險因子，因此發(fā) 展Cys和Hcy的檢測方法具有重要意義。常見檢測硫醇的方法有色譜法和電化學(xué)法等，雖 然這些方法能很好地檢測出硫醇的存在，但這些方法在存在一定的局限性，如設(shè)備成本高、 操作復(fù)雜、耗時長等。因此，需要發(fā)展一種簡單、實時可視化的檢測方法用于硫醇的檢測。 [0003] 熒光成像檢測是一種價格低廉的靈敏非侵入式可視化檢測技術(shù)，熒光成像手段具 有監(jiān)測靈敏、成像迅速和可同時觀測多分子事件等優(yōu)點。另外，熒光探針的豐富促進了熒光 成像技術(shù)的發(fā)展，目前熒光染料大概分為以下幾類：（1)有機熒光染料；（2)磷光金屬配合 物；（3)半導(dǎo)體量子點；(4)熒光蛋白等。其中，磷光銥配合物與傳統(tǒng)的熒光染料相比具有優(yōu) 異的磷光物理性質(zhì)，如具有Stokes位移大、發(fā)光效率高、光穩(wěn)定性好、發(fā)光顏色可調(diào)、發(fā)光 壽命長等優(yōu)點。磷光銥配合物具有較長的發(fā)光壽命，通過時間分辨技術(shù)可以有效地消除自 發(fā)熒光的影響。基于以上的優(yōu)點，已經(jīng)發(fā)展了銥配合物的熒光探針用于半胱氨酸和高半胱 氨酸的熒光檢測，但是目前磷光銥配合物用于半胱氨酸和高半胱氨酸的檢測限于體外離體 檢測和細(xì)胞層次的熒光檢測成像，而未實現(xiàn)小動物活體熒光成像檢測，主要困難在于以下 方面：（1)多數(shù)的配合物熒光探針的激發(fā)光位于紫外區(qū)域，而位于紫外區(qū)域的激發(fā)光在活 體熒光成像上存在組織穿透深度不夠、對活體組織有光損傷的缺點；（2)配合物熒光探針 的發(fā)光量子效率低，不能很好地實現(xiàn)活體熒光成像的應(yīng)用。所以，本發(fā)明針對以上的困難， 通過設(shè)計與合成近紅外磷光發(fā)射的銥配合物的熒光探針，發(fā)展了該探針用于細(xì)胞和活體層 次上的半胱氨酸和高半胱氨酸的熒光成像檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種磷光銥配合物的合成，該配合物具有醛基結(jié)構(gòu)，可以用于檢測 半胱氨酸或高半胱氨酸，而且配合物的發(fā)射光譜位于近紅外區(qū)域，具有光損傷小、組織穿透 性強的特點，可用于細(xì)胞和活體的熒光成像。
[0005] 1.本發(fā)明提供的一種磷光銥配合物化學(xué)式為[Ir(CH0-btiq)2(bpy)] [PF6]，結(jié)構(gòu) 式如式1所示
[0006]
[0007] 2.本發(fā)明還提供了該配合物的合成方法，合成步驟如下：
[0008] a)稱取2-4mmol的2-氯喹啉-3-甲醛和2-4mmol的苯并噻吩-2-硼酸于IOOmL 圓底燒瓶中，加入3摩爾當(dāng)量碳酸鉀，加入40-50mL體積比V/V= 1 :1的四氫呋喃和水混合 溶劑，最后加入8%摩爾當(dāng)量的四（三苯基磷）鈀，在氮氣保護氣氛中70°C加熱回流24至 48小時。反應(yīng)結(jié)束后，用二氯甲烷萃取，水相用二氯甲烷萃取三次，合并有機相，用無水硫酸 鈉干燥過夜，柱層析分離，得到結(jié)構(gòu)式如式II的配體。
[0009]
[0010] b)稱取l_2mmol的配體II，0. 5-lmmol的三水合氯化銥于50mL圓底燒瓶中，加入 20-30mL體積比V/V= 3 :1的乙二醇乙醚和水混合溶劑，在氮氣氣氛中IKTC加熱回流24 至48小時。反應(yīng)得到紅褐色沉淀，減壓抽濾，用水和乙醇洗滌3次，得到如式III的二氯橋 銥配合物。
[0011] c)稱取0. 2-0. 5mmol的二氯橋配合物，0. 4-1.Ommol的1，10-鄰菲羅啉于50mL圓 底燒瓶中，加入24-30mL體積比V/V= 1 :2的甲醇和二氯甲烷混合溶劑，在氮氣氣氛中50°C 加熱回流5-10小時，向反應(yīng)體系中加入5-10摩爾當(dāng)量六氟磷酸鉀，室溫下攪拌2至4小 時，減壓抽濾收集濾液，進行柱層析分離，得到結(jié)構(gòu)式I的銥配合物[Ir(CH0-btiq)2(bpy)] [PF6] 〇
[0012] 3.本發(fā)明還提供該磷光銥配合物在檢測半胱氨酸和高半胱氨酸中的應(yīng)用，在所述 的應(yīng)用中：
[0013] a)用體積比V/V= 4:1的乙腈和水混合溶劑將該磷光銥配合物配制成10-20yM 的稀溶液；
[0014] b)配制l-2mmol的半胱氨酸或高半胱氨酸水溶液；
[0015] c)在銥配合物的稀溶液中加入0-40摩爾當(dāng)量的半胱氨酸、高半胱氨酸水溶液， 37°C反應(yīng)5小時；
[0016] d)用熒光分光光度計檢測銥配合物溶液的熒光變化。
[0017] 4.本發(fā)明還提供了該磷光銥配合物在相同條件下對其他氨基酸的響應(yīng)情況，在所 述的應(yīng)用中：
[0018] a)用體積比V/V= 4:1的乙腈和水混合溶劑將該磷光銥配合物配制成10yM的稀 溶液；
[0019] b)配制濃度為l-2mmol的常見的氨基酸水溶液，包括甘氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、 谷胱甘肽、甲硫氨酸、精氨酸、酪氨酸、丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇 氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、纈氨酸、異亮氨酸、組氨酸；
[0020] c)在銥配合物稀溶液中加入相同當(dāng)量的上述氨基酸水溶液，37°C反應(yīng)5小時； [0021]d)用熒光分光光度計檢測銥配合物溶液的熒光變化。
[0022] 5.該發(fā)明提供了該磷光銥配合物在細(xì)胞成像中的應(yīng)用，在所述應(yīng)用中：
[0023] a)將5yM的銥配合物PBS溶液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，在37°C下孵化30min，用激 光共聚焦熒光顯微鏡進行細(xì)胞熒光成像，收集熒光通道為650 ±IOnm和680 ± 10nm。
[0024] b)分別往上述含銥配合物培養(yǎng)液中加入50yMCys和Hcy，在37°C下孵化3小時， 用激光共聚焦熒光顯微鏡進行細(xì)胞熒光成像，收集熒光通道為650 ±IOnm和680 ± 10nm。
[0025] 6.該發(fā)明提供了該磷光銥配合物在細(xì)胞成像中的應(yīng)用，在所述應(yīng)用中：
[0026] 將100yL的10yM銥配合物生理鹽水溶液通過皮下注射到裸鼠的腹部，同時注射 100yL的100yMHcy生理鹽水溶液。采用515nm激光器進行激發(fā)，收集的熒光范圍為大于 630nm的發(fā)射信號。
[0027] 有益效果：鑒于目前半胱氨酸和高半胱氨酸的檢測磷光銥配合物探針，其激發(fā)光 的缺陷不能有效地實現(xiàn)熒光活體成像。磷光銥配合物具有顯著的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系，可以通過 改變配體結(jié)構(gòu)來改變配合物的功能和性質(zhì)，可以使磷光銥配合物的發(fā)射光譜落在近紅外區(qū) 域。近紅外熒光探針在生物成像中具有光損傷小、組織穿透性強和背景自發(fā)熒光干擾小的 特點，在生物成像上具有優(yōu)勢。綜上所述，我們通過改變銥配合物的配體結(jié)構(gòu)，使磷光銥配 合物具有半胱氨酸、高半胱氨酸檢測和近紅外發(fā)光的性能，將該熒光探針用于細(xì)胞和活體 上半胱氨酸和高半胱氨酸的可視化熒光成像檢測。
【附圖說明】
[0028] 圖1銥配合物[Ir(CHO-btiq) 2 (bpy) ] [PF6]溶液加不同當(dāng)量半胱氨酸的吸收光譜。
[0029] 圖2銥配合物[Ir(CHO-btiq)2(bpy)] [PF6]溶液加不同當(dāng)量半胱氨酸的磷光發(fā)射 光譜。
[0030] 圖3銥配合物[Ir(CHO-btiq)2(bpy)] [PF6]溶液加不同當(dāng)量高半胱氨酸的吸收光 譜。
[0031] 圖4銥配合物[Ir(CHO-btiq)2(bpy)] [PF6]溶液加不同當(dāng)量高半胱氨酸的磷光發(fā) 射光譜。
[0032] 圖5銥配合物[Ir(CHO-btiq)2(bpy)] [PF6]對半胱氨酸/高半胱氨酸的特異性響 應(yīng)。
[0033] 圖6銥配合物[Ir(CH0-btiq)2(bpy)] [PF6]的細(xì)胞熒光成像。
[0034] 圖7銥配合物[Ir(CHO-btiq) 2 (bpy) ] [PF6]的活體熒光成像。
【具體實施方式】
[0035] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步的說明。
[0036] 下文給出了本發(fā)明化合物的具體實施例，但對本發(fā)明不構(gòu)成任何限制。本實施例 中所用的原料均為已知化合物，可以由商業(yè)途徑獲得，或可按相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計方法合成。
[0037] 在下述實施例中，所涉及的理化參數(shù)由下述儀器測定的=1HNMR譜在Bruker AVANCE核磁儀上采用400MHz測定；質(zhì)譜數(shù)據(jù)在AppliedBiosystemsVOYGERDE-STR型質(zhì) 譜儀上測得；紫外可見吸收光譜在ShimadzuUV-2700型紫外-可見吸收光譜儀上完成；磷 光發(fā)射光譜由PerkinElmerLS-55熒光光譜儀測定；細(xì)胞熒光成像在OLYMPUSFV1000型激 光共聚焦熒光顯微鏡上進行；熒光活體成像在CLINXIVScope7550活體成像系統(tǒng)上完成。
[0038] 實施例1
[0039] 銥配合物[Ir(CHO-btiq)2(bpy)] [PF6]的合成：
[0040] (a)稱取4mmol(766. 4mg) 2_氣陸琳_3_甲酸和4mmol(712.Img)苯并噻吩-2-棚 酸于IOOmL圓底燒瓶中，加入3摩爾當(dāng)量碳酸鉀，加入40mL體積比V/V=1 :1的四氫呋喃 和水混合溶劑，最后加入8%摩爾當(dāng)量的四（三苯基磷）鈀，在氮氣保護氣氛中70°C加熱 回流24小時。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用二氯甲烷萃取，水相用二氯甲烷萃取三次（3X10mL)， 合并有機相，用無水硫酸鈉干燥過夜，減壓除去溶劑后柱層析分離，得到式II的配體 CHO-tbiq。核磁表征數(shù)據(jù)：?NMR(400MHz，CDCl3)S=10. 55 (s，1H)，8. 82 (s，1H)，8. 23 (d，J =8. 5Hz, 1H) , 8. 01 (d,J= 8. 0Hz, 1H) , 7. 98 - 7. 92 (m, 1H) , 7. 89 (dd,J= 7. l，5.9Hz，2H)，7.65(t,J= 7.5Hz,lH)，7.60(s,lH)，7.50 - 7.39(m，2H);質(zhì)譜表征數(shù)據(jù)： MALDI-T0F-MS:m/z322. 7 (M+)〇
[0041 ] (b)稱取lmmol(290. 3mg)配體II(CH〇-tbiq)，0? 5mmol三水合氯化銥于 50mL圓底 燒瓶中，加入28mL體積比V/V= 3 :1的乙二醇乙醚和水混合溶劑，在