一種不同收獲期壇紫菜的鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藻類生長期檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種不同收獲期壇紫菜的鑒別方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 壇紫菜（Pyropiahaitanensis)屬紅藻類，為我國人工養(yǎng)殖的主要海藻品種之一， 是一種理想的高蛋白、低脂肪的食品，富含多種氨基酸及無機(jī)鹽，為廣大消費(fèi)者喜愛。但紫 菜的收割期持續(xù)時(shí)間較長，不同收割期紫菜的品質(zhì)不同，市場(chǎng)價(jià)格相差較大。一般來說，第 一次采割（時(shí)間大約在11月中旬）的紫菜叫一水紫菜，第二次采割（時(shí)間大約在12月下 旬）的紫菜叫二水紫菜，而第三次采割（時(shí)間大約在翌年的1月下旬）的紫菜叫三水紫菜。 但消費(fèi)者很難從形態(tài)上分辨不同收獲期的紫菜，因此，有必要提供一種有效的檢測(cè)不同收 獲期壇紫菜的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的是提供一種不同收獲期壇紫菜的鑒別方法，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不 足。
[0004] 本發(fā)明通過核磁共振技術(shù)分析未知收獲期的紫菜樣品所含的代謝物，再借助多變 量統(tǒng)計(jì)方法分析未知樣品與已知收獲期的紫菜樣品的聚類情況，來判別未知樣品所屬的收 獲期。
[0005] 本發(fā)明的方法，包括如下的步驟：
[0006] 1)待檢測(cè)壇紫菜的預(yù)處理
[0007] 將待檢測(cè)的壇紫菜樣品清洗后，瀝水后置于陰涼處去除表面水分；
[0008] 2)細(xì)胞破壁：
[0009] 將待檢測(cè)的壇紫菜樣品加入甲醇水溶液（甲醇與水的體積比為2 :1)中進(jìn)行細(xì)胞 破碎，使壇紫菜葉片破碎后的粒徑達(dá)到20ym以下來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的破壁；
[0010] 3)離心：
[0011] 將步驟2)破碎后的樣品在10000r/min-15000r/min、0°c-4°c下離心，抽取上清 液，殘?jiān)屑尤爰状妓芤海状妓w積比為2 :1)，振蕩混勻，重復(fù)上述操作3-4次，合并 上清液；
[0012] 4)抽濾：
[0013] 將制備的上清液常溫下于0. 09MPa以上真空度下去除甲醇；
[0014] 5)真空冷凍干燥：
[0015] 將上述真空抽濾后的樣品在-20°C進(jìn)行凍結(jié)后，進(jìn)行真空冷凍干燥至水分含量達(dá) 到2%以下得到樣品；
[0016] 6)核磁譜采集：
[0017] 取上述真空冷凍干燥的樣品加入磷酸緩沖溶液進(jìn)行離心（離心條件如下： 10000r/min-15000r/min，(TC-4°C，5min-20min)得到上清液，上清液在核磁核磁共振儀為 400MHz以上的核磁共振波譜儀進(jìn)行小分子代謝物的檢測(cè)，得到一維1HNMR譜數(shù)據(jù)；
[0018]上述磷酸緩沖液（pH 7. 4)的組成如下：0.2964%NaH2PO4?2H20,1.8486% K2HPO4?3H20,0. 1% NaN3、0. 005% TSP和90% D2O ;余量為水。
[0019] 所述核磁共振技術(shù)鑒定參數(shù)如下：使用標(biāo)準(zhǔn)的NoesyprlD脈沖序列 RD-90。-tl-90° -tm-90。-ACQ采集一維111匪1?譜，在該序列中的等待時(shí)間〇?，28)和 混合時(shí)間（tm，100ms)施加強(qiáng)度約50Hz的低功率連續(xù)波進(jìn)行水峰抑制，每一個(gè)樣品的90° 脈沖寬度均設(shè)置約l〇s，譜寬設(shè)置為20ppm，采樣點(diǎn)數(shù)32K，F(xiàn)ID累加64次；
[0020] 所述的壇紫菜特征小分子代謝物是異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、海帶醇、6-脫 氧-抗壞血酸、乳酸、蘇氨酸、丙氨酸、2-羥基-5-氨基纈草酸、2-氧代-5-氨基纈草酸、乙 酸、谷氨酸、蘋果酸、蘋果酸、琥珀酸、谷氨酰胺、檸檬酸、丙氨酸、天冬氨酸、二甲基巰基 丙酸、天冬酰胺、T-氨基丁酸、膽堿-0-硫酸、羥乙基磺酸、膽堿、甜菜堿、?；撬?、甜菜堿 醛、甘氨酸、異紅藻糖苷和紅藻糖苷。
[0021] 7)數(shù)據(jù)分析：
[0022] 為對(duì)待鑒定的樣品的所有一維1H-NMR譜數(shù)據(jù)經(jīng)傅立葉變換得到譜圖，并依照 C0SY、T0CSY、HSQC和HMBC二維NMR譜對(duì)檢測(cè)到的物質(zhì)進(jìn)行了歸屬；以內(nèi)標(biāo)物（TSP，0ppm)對(duì) 所有一維1HNMR進(jìn)行化學(xué)位移定標(biāo)，調(diào)整相位并校正基線之后，對(duì)NMR譜（0. 8-5. 3)進(jìn)行分 段積分，積分區(qū)間為2. 4Hz;去除殘存的水信號(hào)（4. 6-4. 9)和甲醇信號(hào)（3. 3-3. 4)所在的積 分區(qū)間之后，設(shè)置整個(gè)譜的積分面積總和為1，對(duì)每個(gè)積分區(qū)間的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理；采 用SIMCA-P+軟件對(duì)歸一化的NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量數(shù)據(jù)分析；為獲得各組樣品的聚類情況和 檢測(cè)離群點(diǎn)，首先對(duì)NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA)，在PCA處理中選用標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)處理 模式；為了進(jìn)一步得到對(duì)組間區(qū)分具有顯著性貢獻(xiàn)的化合物，對(duì)NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行了正交偏最 小二乘法判別分析（OPLS-DA)，該分析中選用了自動(dòng)規(guī)格化的數(shù)據(jù)處理模式，并以該自動(dòng)規(guī) 格化的NMR數(shù)據(jù)作為X變量，而分組信息作為Y變量。采用7倍交叉驗(yàn)證和進(jìn)一步的交叉 驗(yàn)證的方差分析來確保OPLS-DA模型的可靠性；在對(duì)自動(dòng)規(guī)格化的NMR數(shù)據(jù)作進(jìn)一步的回 溯轉(zhuǎn)換處理后，再利用MATLAB軟件可獲得OPLS-DA模型的載荷圖；載荷圖上的每一個(gè)點(diǎn)用 顏色來表征，不同顏色對(duì)應(yīng)于自動(dòng)規(guī)格化的權(quán)重值，權(quán)重即表示回溯轉(zhuǎn)換處理后的變量（X) 和分組變量（Y)之間的皮爾森積差相關(guān)系數(shù)（r);
[0023] 8)樣品收獲期的鑒別：
[0024] 根據(jù)步驟7)得到的壇紫菜提取物的NMR數(shù)據(jù)的PCA模型的結(jié)果分析，其中PCA模 型的PCl解釋80% -85%的變量，而PC2解釋10% -15%的變量；其中，前期采割的紫菜與 中期采割的紫菜體現(xiàn)在PC2上的區(qū)分，而后期采割的紫菜要體現(xiàn)在PCl上的區(qū)分。
[0025] 本發(fā)明通過核磁共振氫譜法測(cè)定不同收獲期壇紫菜總提取物中小分子物質(zhì)的變 化，前處理方法簡單，檢測(cè)速度快，不同海域不同時(shí)期的壇紫菜具有很好的重現(xiàn)性和高度的 特征性。
【附圖說明】
[0026]圖1 :基于核磁共振方法鑒別不同收獲期壇紫菜的方法流程圖。
[0027]圖2:實(shí)施例1中一水（Hl)、二水（H2)、三水（H3)壇紫菜提取物的1HNMR譜。
[0028]圖3:為實(shí)施例：1中一水（HI)、二水（H2)、三水（H3)壇紫菜提取物的PCA得分圖。
[0029]圖4:實(shí)施例1中一水（Hl)、二水（H2)、三水（H3)壇紫菜提取物的OPLS-DA得分 圖（左）和相關(guān)系數(shù)圖（右）。
【具體實(shí)施方式】
[0030] 本發(fā)明使用的核磁共振（NuclearMagneticResonance，簡稱NMR)是指具有固定 磁矩的原子核，如lH、13C、31P、19F、15N、129Xe等，在恒定磁場(chǎng)與交變磁場(chǎng)的作用下，與交 變磁場(chǎng)發(fā)生能量交換的現(xiàn)象。
[0031] 以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0032] 實(shí)施例1
[0033] 如圖1所示，本實(shí)施例中通過核磁共振技術(shù)對(duì)采割于11月的第一批（下文簡稱一 水）、采割于12月的第二批（下文簡稱二水）、采割于翌年1月的第三批（下文簡稱三水） 壇紫菜進(jìn)行鑒別的方法，依次包括預(yù)處理、破碎、離心、抽濾、真空冷凍干燥、核磁譜采集、數(shù) 據(jù)分析和鑒別，其具體步驟如下：
[0034] 1)預(yù)處理步驟為：分別將一水、二水和三水壇紫菜經(jīng)二級(jí)沙濾海水清洗后，瀝水 后置于陰涼處吹去表面水分。
[0035] 2)破碎步驟為：分別取經(jīng)預(yù)處理的一水、二水、三水壇紫菜，稱量0.Ig至2mL的 離心管中，加入甲醇水溶液（甲醇水的體積比=2 :l)lmL，選取破碎轉(zhuǎn)速5000r/min，每次 45s，循環(huán)15次，進(jìn)行細(xì)胞破碎，使破碎后紫菜粒徑達(dá)到20ym以下，每個(gè)樣品平行數(shù)目為 10。
[0036] 3)離心步驟為：將上述破碎后樣品進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速12000r/min，4°C，lOmin，抽取 上清液，殘?jiān)屑尤爰状妓芤海状妓w積比為2 :1)lmL，振蕩混勻，重復(fù)上述操作3-4 次，合并上清液。
[0037] 4)抽濾步驟為：合并離心過程中所取上清液，放入真空干燥箱進(jìn)行抽濾，真空度 0. 095MPa，室溫條件，以去除甲醇。
[0038] 5)真空冷凍干燥步驟為：將抽濾結(jié)束的上清液放入_20°C的冰箱凍結(jié)12h，然后取 出進(jìn)行真空冷凍干燥48h，至水分含量達(dá)到2%以下，結(jié)束后密封放入-20°C冰箱凍藏備用。
[0039] 6)核磁譜采集步驟為：取經(jīng)真空冷凍干燥的樣品至2毫升的離心管中，加入600uL 磷酸緩沖溶液（K2HP04/NaH2P04,0. 1M，pH7. 4)，于 4°C，10000r/min，IOmin條件下進(jìn)行離心 后，取上清液550uL于2mL的核磁管內(nèi)，使用600MHz核磁共振波譜儀進(jìn)行采集。
[0040] 數(shù)據(jù)分析步驟為：對(duì)待鑒定的樣品的所有一維1H-NMR譜數(shù)據(jù)經(jīng)傅立葉變換得到譜 圖，并依照COSY、T0CSY、HSQC和HMBC二維NMR譜對(duì)檢測(cè)到的物質(zhì)進(jìn)行了歸屬。有代表性的 一水、二水和三水的紫菜核磁譜見圖2。本發(fā)明共檢測(cè)到31種代謝物，包括亮氨酸、亮氨酸、 纈氨酸、海帶醇、6-脫氧-抗壞血酸、乳酸、蘇氨酸、丙氨酸、2-羥基-5-氨基纈草酸、2-氧 代-5-氨基纈草酸、乙酸、谷氨酸、蘋果酸、蘋果酸、琥珀酸、谷氨酰胺、檸檬酸、P-丙氨酸、 天冬氨酸、二甲基巰基丙酸、天冬酰胺、T-氨基丁酸、膽堿-〇-硫酸、羥乙基磺酸、膽堿、甜 菜堿、?；撬?、甜菜堿醛、甘氨酸、異紅藻糖苷和紅藻糖苷。這些代謝物的詳細(xì)NMR信息見表 1〇
[0041] 以內(nèi)標(biāo)物（TSP，Oppm)對(duì)所有一維1HNMR進(jìn)行化學(xué)位移定標(biāo)，調(diào)整相位并校正基線 之后，對(duì)NMR譜（0. 8-5. 3)進(jìn)行分段積分，積分區(qū)間為2. 4Hz。去除殘存的水信號(hào)（4. 6-4. 9) 和甲醇信號(hào)（3.3-3.4)所在的積分區(qū)間之后，設(shè)置整個(gè)譜的積分面積總和為1，對(duì)每個(gè)積分 區(qū)間的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理。采用SHCA-P+軟件對(duì)歸一化的NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量數(shù)據(jù)分 析。為獲得各組樣品的聚類情況和檢測(cè)離群點(diǎn)，首先對(duì)NMR數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析（PCA)