Gpi膠乳增強(qiáng)免疫比濁法體外定量測(cè)定診斷試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用膠乳增強(qiáng)免疫比濁方法測(cè)定人體體液（包括血清和關(guān)節(jié)腔 積液）中GPI (葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶，Glucose-6-phosphateisomerase)含量的試劑盒，屬 于醫(yī)學(xué)免疫體外診斷領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 葡萄糖 _6_ 磷酸異構(gòu)酶（glucose-6-phosphateisomerase，GPI或G6PI)是糖酵 解和糖異生過(guò)程中的一種重要酶類，GPI缺乏會(huì)引起人非球形紅細(xì)胞性溶血性貧血，在類 風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA)患者的血清和關(guān)節(jié)液中其濃度明顯增高，在多種癌癥比如胃腸癌，胸腺 癌，腎臟癌癥中也被發(fā)現(xiàn)其濃度明顯增高。
[0003]GPI廣泛存在于各種細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，目前研究發(fā)現(xiàn)，GPI存在24個(gè)同種異構(gòu)體，其結(jié) 構(gòu)特點(diǎn)極其相似。GPI存在于各種細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，是糖酵解和糖異生的重要酶類，并可作為一 種細(xì)胞因子或生長(zhǎng)因子分泌于細(xì)胞外，刺激細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，與腫瘤的代謝與發(fā)展密切相關(guān)。其基 因位于第十九號(hào)染色體，基因跨度大于40kbp，包括18個(gè)內(nèi)含子。17個(gè)外顯子，蛋白全長(zhǎng)約 56ku，是一種多功能分子，于真核生物、細(xì)菌和原核生物以及人體各組織細(xì)胞中廣泛存在。 它的主要功能是催化6-磷酸葡萄糖和6-磷酸果糖之間的轉(zhuǎn)化，并可誘導(dǎo)髓樣干細(xì)胞向單 核細(xì)胞以及B細(xì)胞向成熟抗體分泌細(xì)胞的分化。GPI缺乏會(huì)引起人非球形紅細(xì)胞性溶血性 貧血，同時(shí)會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)損害癥狀。這是一種常染色體隱性遺傳性疾病，而實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該病由于 插入了脯氨酸，H20 -P和L339 -P變異影響酶的折疊和活化從而引起相應(yīng)臨床癥狀。
[0004]GPI是體內(nèi)的一種自身抗原，有研究表明，GPI在RA患者尤其在活動(dòng)期血清和關(guān)節(jié) 液中明顯增高，并出現(xiàn)GPI水平與RA疼痛和腫脹關(guān)節(jié)數(shù)呈正相關(guān)。RA是以關(guān)節(jié)慢性炎癥損 傷為主的自身免疫性疾病，發(fā)病兩年內(nèi)即可出現(xiàn)不可逆的骨關(guān)節(jié)破壞，其確切病因和發(fā)病 機(jī)制至今尚不完全清楚。因而RA的早期診斷，治療對(duì)控制該病的病情非常重要。而RA作 為一種免疫功能紊亂所引起的自身免疫性疾病，患者體內(nèi)有多種自身抗原和自身抗體，不 同患者的自身抗原可能不同。有文獻(xiàn)報(bào)道，GPI抗原存在于大多RA患者血清和關(guān)節(jié)液中，血 清中GPI抗原以0. 33ug/ml或0. 2ug/ml作為陽(yáng)性分界點(diǎn)，可檢測(cè)出大部分的RA患者。有 研究顯示，GPI與RA患者的病程、功能分級(jí)、腫脹關(guān)節(jié)數(shù)、壓痛關(guān)節(jié)數(shù)、握力及晨僵持續(xù)時(shí)間 存在相關(guān)性，而與年齡無(wú)關(guān)，提示GPI對(duì)于RA患者的病情發(fā)展程度以及預(yù)后判斷也有一定 的指導(dǎo)意義。
[0005] 在RA患者中，GPI作為自身抗原可誘導(dǎo)機(jī)體其它免疫細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子引起關(guān)節(jié) 炎，GPI同時(shí)也與抗GPI自身抗體結(jié)合，形成免疫復(fù)合物引起關(guān)節(jié)炎癥狀的進(jìn)一步加重。近 年來(lái)有文獻(xiàn)報(bào)道在RA患者的血清和關(guān)節(jié)液中檢測(cè)到了高水平的GPI抗體和可溶性GPI分 子。此外，Kassahn等在RA患者的血清和關(guān)節(jié)液中發(fā)現(xiàn)高水平的GPI及其免疫復(fù)合物，通 過(guò)激光共聚焦顯微鏡和免疫組化發(fā)現(xiàn)RA患者的關(guān)節(jié)滑膜或滑膜的小動(dòng)脈及毛細(xì)血管有高 密度的GPI表達(dá)，認(rèn)為可能與血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)有關(guān)。因此，一些文獻(xiàn)認(rèn)為GPI可 能是通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞或滑膜液中的可溶性蛋白遞呈給免疫系統(tǒng)，同時(shí)GPI免疫復(fù)合物還可通 過(guò)FC受體介導(dǎo)替代途徑激活補(bǔ)體誘發(fā)或加重關(guān)節(jié)炎癥。另外，有學(xué)者還發(fā)現(xiàn)IgG的沉淀 干擾了軟骨表面的保護(hù)因子通路，GPI-抗GPI抗體復(fù)合物覆蓋在軟骨表面，引起硅酸鹽類 物質(zhì)的破壞，從而引起關(guān)節(jié)破壞。而Yu等在腫瘤細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)GPI可以調(diào)芐基質(zhì)金屬酶蛋白 23(matrixmetalloproteinase23,MMP23)，MMP23在RA患者的滑膜細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞、 成纖維細(xì)胞中高表達(dá)，有明顯促進(jìn)骨破壞的作用，甚至有促進(jìn)淋巴細(xì)胞增生的作用。由此說(shuō) 明GPI抗原與RA滑膜增生、血管翳形成、骨與軟骨的破壞密切相關(guān)?？傊珿PI與RA發(fā)病 有高度的相關(guān)性，高水平的GPI通過(guò)多種可能機(jī)制誘發(fā)RA的發(fā)生。
[0006] 目前常用的葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶的檢測(cè)是采用雙抗體夾心法（ELISA)原理對(duì)人 血清或人關(guān)節(jié)腔積液中GPI進(jìn)行檢測(cè)。ELISA法試劑盒用純化的抗體包被微孔板制成固相 抗體，向包被單抗的微孔中依次加入GPI、生物素化的抗人GPI抗體、HRP標(biāo)記的親和素，經(jīng) 過(guò)徹底洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過(guò)氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn) 化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的GPI呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸 光度值（0D值），計(jì)算樣品濃度，其濃度在0. 16ug/ml以下為正常，在0. 16-0. 33ug/ml為可 疑，大于〇.33ug/ml時(shí)為陽(yáng)性。ELISA法雖然對(duì)設(shè)備要求較低，但是步驟繁瑣，耗時(shí)耗力，不 利于大規(guī)模檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明提供一種利用膠乳增強(qiáng)免疫比濁方法測(cè)定人體體液（包括血清和關(guān)節(jié)腔 積液）中GPI含量的試劑盒，所述試劑盒包括：（I)GPIRl試劑；（2)GPIR2試劑；（3)GPI校 準(zhǔn)品。
[0008] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案包括：
[0009] (I)GPIRl試劑，是一種為試劑盒提供適當(dāng)反應(yīng)環(huán)境、使抗原保持天然構(gòu)象并控制 反應(yīng)達(dá)到終點(diǎn)的時(shí)間和速率的試劑，包含電解質(zhì)、促凝劑、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑及緩 沖液。
[0010] (2)GPIR2試劑，是一種含有抗人GPI多克隆抗體包被膠乳顆粒的均一的乳白色 液體，包含抗人GPI多克隆抗體包被膠乳顆粒、電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、表面活性劑、防腐劑及緩沖 液。
[0011] (3)GPI校準(zhǔn)品，用來(lái)與樣本比較進(jìn)行結(jié)果計(jì)算，包含防腐劑、電解質(zhì)、穩(wěn)定劑、GPI 抗原及緩沖液。
[0012] 在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，膠乳比濁法測(cè)定人體體液（包括血清和關(guān)節(jié)腔積液） 中GPI含量的試劑盒包括：GPIRl試劑、GPIR2試劑和GPI校準(zhǔn)品，其中：
[0013] 所述GPIRl試劑的主要成分為：0. 1 %-5.0%電解質(zhì)、2%-6%促凝劑、0. 1 %-1 % 穩(wěn)定劑、〇. 1% -1. 〇%表面活性劑、〇. 05% -0. 1%防腐劑及pH7-9、濃度范圍為IO-IOOmmol/ L的緩沖液；
[0014] 所述GPIR2試劑的主要成分為抗人GPI多克隆抗體包被膠乳顆粒和占其質(zhì)量百 分比為：〇. 1% -5. 0%電解質(zhì)、0. 5% -5%穩(wěn)定劑、0. 1% -1. 0%表面活性劑、0. 05% -0. 1% 防腐劑及PH7-9、濃度范圍為10-100mm〇l/L的緩沖液；
[0015] 所述GPI校準(zhǔn)品的主要成分為：0.1% -5.0%電解質(zhì)、0.5% -5%穩(wěn)定劑、 0. 05% -0. 1%防腐劑、0-330ng/mlGPI抗原及溶解在預(yù)處理的人血清基質(zhì)中、pH6. 5-8. 0、 濃度為10-100mm〇l/L的緩沖液。
[0016] 本發(fā)明所用的多克隆抗體?？蛇x自綿羊或兔子等健康的免疫動(dòng)物，此類抗體效價(jià) 高成本低，具有一定優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明所用的膠乳顆粒，直徑范圍為60-300nm，濃度為0.l-5mg/ ml。本發(fā)明所述膠乳顆粒為聚苯乙烯膠乳，其表面修飾有功能團(tuán)，功能團(tuán)可以是羧基、氨基、 羥基、酰肼或氯甲基的一種。在本發(fā)明的一實(shí)施方案中，所用膠乳顆粒優(yōu)選表面修飾羧基， 直徑在80_140nm，優(yōu)選120nm。
[0017] 本發(fā)明所用的包被抗體到膠乳顆粒表面的方法為化學(xué)交聯(lián)法，該方法是通過(guò)化 學(xué)交聯(lián)劑在交聯(lián)緩沖液中進(jìn)行的，所用的化學(xué)交聯(lián)劑選自碳化亞胺、N-羥基琥珀酰亞胺、 N-羥基硫代琥珀酰亞胺、酰肼、異氰酸酯或其組合：交聯(lián)緩沖液選自不含氨基的緩沖液， MES、M0PS0、MOPS、HEPES、磷酸鹽緩沖液，pH在 6. 0-8. 0 之間。
[0018] 本發(fā)明所述電解質(zhì)選自無(wú)機(jī)鹽類，氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂、硫酸鎂或其組合，優(yōu)選 氯化鈉，濃度在〇. 1% -5.0%之間。
[0019] 本發(fā)明所述穩(wěn)定劑選自牛血清白蛋白、酪蛋白、魚皮明膠蛋白、葡萄糖、果糖、甘露 醇、殼聚糖、山梨醇、乙二胺四乙酸二鈉或其組合。
[0020] 本發(fā)明所述促凝劑選自PEG-4000、PEG-6000、PEG-8000、硫酸葡聚糖鈉，優(yōu)選 PEG-6000〇
[0021] 本發(fā)明所用表面活性劑選自吐溫系列、脂肪醇聚乙二醇醚類、聚氧乙烯苯基醚、聚 氧乙烯月桂醚系列或其組合，優(yōu)選吐溫20。
[0022] 本發(fā)明所述防腐劑選自疊氮鈉、苯酚、對(duì)羥基苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸乙酯、ProClin 系列、三嗪類有機(jī)化合物等，優(yōu)選疊氮鈉。
[0023] 本發(fā)明所述GPI校準(zhǔn)品，包含含量在0-330ng/mlGPI抗原，其中所述GPI校準(zhǔn)品 1為不含GPI抗原的預(yù)處理人血清；GPI校準(zhǔn)品2、3、4、5、6為添加不同GPI抗原含量的預(yù)處 理血清。
[0024]本發(fā)明所述GPI校準(zhǔn)品中的GPI選自從人體體液中提取、純化而得的天然GPI，純 度彡95%。
[0025] 本發(fā)明試劑盒，采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法定量檢測(cè)GPI，其原理是：利用化學(xué)交聯(lián) 法將特異的羊抗人GPI多克隆抗體包被到膠乳顆粒表面，當(dāng)被測(cè)樣本中有GPI抗原時(shí)發(fā)生 抗原抗體免疫反應(yīng)，形成抗原-抗體-膠乳顆粒復(fù)合物，形成的復(fù)合物可與鄰近的膠乳顆粒 連接，最終交織成網(wǎng)狀引起反應(yīng)體系池度的顯著變化，保持反應(yīng)體系中抗體過(guò)量時(shí)，此時(shí)反 應(yīng)后體系濁度的變化與GPI的量成正比，根據(jù)GPI校準(zhǔn)曲線即可進(jìn)行定量分析。
[0026] 在本發(fā)明中，人體體液中的GPI與膠乳顆粒包被的羊抗人GPI多克隆抗體發(fā)生抗 原抗體反應(yīng)，形成抗原-抗體-膠乳顆粒的復(fù)合物，導(dǎo)致濁度上升，測(cè)定此濁度在570nm波 長(zhǎng)處得吸光度，對(duì)照校準(zhǔn)曲線即可求出樣本中GPI的含量。
[0027] 相較于現(xiàn)有的ELISA法試劑盒，本發(fā)明用化學(xué)交聯(lián)法將特異性的羊抗人GPI抗體 包被到羧基修飾過(guò)的膠乳顆粒表面，并通過(guò)添加穩(wěn)定劑和表面活性劑使膠乳顆粒形成均一 穩(wěn)定的懸浮液，實(shí)現(xiàn)均相免疫反應(yīng)體系，使用簡(jiǎn)便快速，適應(yīng)臨床快速高通量篩查的要求。