一種檢測急性t淋巴細(xì)胞白血病幼稚t細(xì)胞的試劑盒、應(yīng)用及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及細(xì)胞表型確認(rèn)的專用試劑盒，具體涉及一種用于 分析急性T淋巴細(xì)胞白血病的白血病幼稚T細(xì)胞（leukemicblasticTcell，LBTC)表型 的試劑盒、應(yīng)用及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 急性T淋巴細(xì)胞白血病（T-lineageacutelymphoblasticleukemia，T-ALL)在 兒童急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cutelymphoblasticleukemia，ALL)和成人ALL中分別占15% 和25%，異質(zhì)性大。隨著治療方案的優(yōu)化，兒童ALL的誘導(dǎo)緩解率和長期生存率得到了顯著 提高，但T-ALL的預(yù)后仍然較差；成人ALL總體的5年無事件生存僅在30%左右，而T-ALL 的長期生存更差。由于目前微小殘留檢測水平有限，復(fù)發(fā)成為T-ALL患者治療失敗的主要 原因，也是影響長期生存的重要問題，復(fù)發(fā)后的患者，即使加強化療或進行造血干細(xì)胞移植 等挽救措施，預(yù)后仍然較差，多數(shù)患者因此而喪生。
[0003]T-ALL是一種骨髓中幼稚T細(xì)胞惡性增長的疾病，T細(xì)胞分化發(fā)育的主要場所是 胸腺，正常機體胸腺內(nèi)可見不同發(fā)育階段的T細(xì)胞，胸腺內(nèi)早期幼稚T細(xì)胞表達(dá)CD34、TdT、 ⑶7和胞漿⑶3 (c⑶3)，⑶45表達(dá)較弱，胞膜⑶3 (mCD3)陰性，隨著細(xì)胞成熟，⑶34和TdT相 繼消失，⑶45表達(dá)增強，mCD3轉(zhuǎn)為陽性；骨髓中的正常T細(xì)胞為成熟T細(xì)胞，表型為⑶45st r+cCD3+CD7+mCD3+CD5+TdT-CD34-，CD34+ 和TdT+ 的幼稚T細(xì)胞比例極低。T-ALL患者主要 表現(xiàn)為骨髓或外周血中幼稚T細(xì)胞明顯增加，常伴早期抗原CD34和TdT表達(dá)、mCD3多為陰 性或弱表達(dá)、⑶5陰性或弱表達(dá)、⑶4和⑶8雙陰或雙陽等，與成熟T細(xì)胞表型有明顯差別， 這些標(biāo)志均是LBTC相關(guān)免疫表型特點，用以區(qū)別正常T細(xì)胞。LBTC表型還可出現(xiàn)：抗原不 同步表達(dá)(如mCD3和⑶2同時弱陽性)、抗原系列不保真(髓系抗原⑶13和⑶33陽性)、抗 原表達(dá)缺失(如⑶2陰性）或抗原表達(dá)強度改變(如⑶7強表達(dá)、⑶45弱表達(dá)）等。
[0004] 由于發(fā)病率較低，有關(guān)初診及治療后T-ALL患者的檢測報道較少，且多是采用三 色或四色抗體組合，在檢測治療后ALL-T幼稚細(xì)胞時國際上普遍根據(jù)初診時的免疫表型， 設(shè)計治療后檢測的抗體，一般采用3-4管3色或4色抗體組合，如果沒有初診時的免疫表 型，則無法利用較少的抗體組合進行治療后白血病細(xì)胞的檢測。而國內(nèi)部分患者由于初診 時就診醫(yī)院的醫(yī)療條件較差，沒有進行全面的抗原檢測，缺乏初診時免疫表型資料，對此類 患者，按照國際上的慣例則不能利用較少的抗體進行檢測，需按照初診時檢測免疫表型的 方法，使用多種抗體對患者進行全面的抗原分析，費用較高。
[0005] 另一方面，早期文獻(xiàn)報道，胸腺中的幼稚T細(xì)胞出現(xiàn)在骨髓或外周血時，稱為異位 性表達(dá)。胸腺中早期幼稚T細(xì)胞表達(dá)⑶34和/或TdT，當(dāng)時依據(jù)的主要抗原是TdT和⑶7， 因此認(rèn)為當(dāng)骨髓或外周血中TdT+CD7+幼稚T細(xì)胞比例增高時，則為微小殘留病陽性，但對 于T-ALL治療后骨髓中CD34+TdT+cCD3+的T細(xì)胞比例增高的樣本，其是否是LBTC、是否說 明白血病細(xì)胞增加還是非特異性結(jié)合尚不清楚。因此，對治療后患者檢測LBTC時，如何準(zhǔn) 確、快速、簡單的對非特異結(jié)合的細(xì)胞進行排除性鑒別也是本領(lǐng)域的難題之一。
[0006] 可見，開發(fā)具有疾病特異性的、較少量抗體組合的試劑，廣泛適用于初診患者，同 時對于多數(shù)治療后T-ALL患者、T-ALL復(fù)診患者，可不依賴于初診時的免疫分型資料，鑒別LBTC對本領(lǐng)域技術(shù)的進步具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種檢測急性T淋巴細(xì)胞白血病幼稚T細(xì)胞 的試劑盒、應(yīng)用及方法，利用該試劑盒中的專用試劑和配套使用方法、借助七色流式細(xì)胞儀 的輔助，可以快速、準(zhǔn)確地分析T-ALL患者LBTC的抗原表達(dá)，對T-ALL患者體內(nèi)異常幼稚T 細(xì)胞快速、準(zhǔn)確分類，還可作為組成用于制備診斷急性T淋巴細(xì)胞白血病的產(chǎn)品。
[0008] 本發(fā)明采取的技術(shù)方案是： 一種檢測急性T淋巴細(xì)胞白血病幼稚T細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒的應(yīng)用基于流式細(xì)胞 儀，所述試劑盒中配置了針對包括下述物質(zhì)的單克隆抗體：TdT、c⑶3、⑶34、⑶5、⑶7、mCD3 和CD45,所述抗體分別帶有熒光標(biāo)記。
[0009] 優(yōu)選的，所述針對TdT、c⑶3、⑶34、⑶5、⑶7、mCD3和⑶45的單克隆抗體依次帶有 下述熒光標(biāo)記：FITC、PE、PerCP-Cy5. 5、PE-Cy7、APC、APC-Cy7和PacificBlue。
[0010] 優(yōu)選的，所述試劑盒中還包括紅細(xì)胞溶解液和和包含細(xì)胞固定液、破膜液的固定/ 破膜劑。
[0011] 本發(fā)明還提供上述試劑盒在制備診斷急性T淋巴細(xì)胞白血病的產(chǎn)品中的應(yīng)用，對 樣本依次進行下述預(yù)處理步驟： ① 將樣本與CD34-PerCP-Cy5. 5、CD5-PE-Cy7、CD7-APC、mCD3-APC-Cy7和 CD45-PacificBlue混勻后避光室溫孵育10-20分鐘，得混合液I; ② 向混合液I加入紅細(xì)胞溶解液，混勻后避光，室溫放置5-10分鐘，以1000-2000轉(zhuǎn) /分、離心5-10分鐘，棄上清，向沉淀中加入細(xì)胞固定液，混勻后避光孵育10-20min; ③ 加入pH為7. 2~7. 4的PBS緩沖液，混勻，1000-2000轉(zhuǎn)/分、離心5-10分鐘，棄上 清，向沉淀中加入破膜液，同時加入TdT-FITC和CCD3-PE，混勾，避光孵育5-10分鐘； ④ 加入含血清0. 5%~2%的PBS緩沖液，混勻，1000-2000轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘，棄上 清，向沉淀中加入pH為7. 2~7. 4的PBS緩沖液，混勻即得待測樣本。
[0012] 優(yōu)選的，所述待測樣本采用流式細(xì)胞儀進行測試，并借助分析軟件按下述步驟分 析數(shù)據(jù)： ① 先建立FSC/SSC密度圖，將有核細(xì)胞區(qū)域設(shè)門標(biāo)記為Pl; ② 對Pl內(nèi)細(xì)胞建立c⑶3/SSC二維散點圖，將c⑶3+SSC小細(xì)胞設(shè)門標(biāo)記為P2 ; ③ 對P2門內(nèi)細(xì)胞建立⑶45/c⑶3二維散點圖，將c⑶3+⑶45+/dim+細(xì)胞設(shè)門標(biāo)記為 P3 ； ④ 對P3門內(nèi)細(xì)胞建立⑶34/⑶5、TdT/⑶7和⑶5/mCD3二維散點圖，分別顯示各群細(xì)胞 的比例及⑶34+和TdT+細(xì)胞在有核細(xì)胞中的比例，比較⑶34、TdT、⑶7、⑶5和mCD3的熒 光表達(dá)強度與正常T細(xì)胞的表達(dá)強度。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種檢測急性T淋巴細(xì)胞白血病幼稚T細(xì)胞的方法，基于流式細(xì) 胞儀，所述方法包括以下步驟： (1) 對樣本依次進行下述預(yù)處理： ① 將樣本與CD34-PerCP-Cy5. 5、CD5-PE-Cy7、CD7-APC、mCD3-APC-Cy7和 CD45-PacificBlue混勻后避光室溫孵育10-20分鐘，得混合液I; ② 向混合液I加入紅細(xì)胞溶解液，混勻后避光，室溫放置5-10分鐘，以1000-2000轉(zhuǎn) /分、離心5-10分鐘，棄上清，向沉淀中加入固定/破膜劑中細(xì)胞固定液，混勻后避光孵育 l〇-20min； ③ 加入pH為7. 2~7. 4的PBS緩沖液，混勻，1000-2000轉(zhuǎn)/分、離心5-10分鐘，棄上 清，向沉淀中加入破膜液，同時加入TdT-FITC和CCD3-PE，混勾，避光孵育5-10分鐘； ④ 加入含血清0. 5%~2%的PBS緩沖液，混勻，1000-2000轉(zhuǎn)/分離心5-10分鐘，棄上 清，向沉淀中加入pH為