空腸彎曲菌酶聯(lián)免疫檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)和免疫學領(lǐng)域，具體涉及一種檢測空腸彎曲菌的酶聯(lián)免疫試 劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]空腸彎曲菌（Campylobacterjejunienteritis)是 1973 年Butzler等自腹瀉病 人糞便中分離出來，目前已認識其為人類腹瀉的主要致病菌之一?？漳c彎曲菌腸炎的發(fā)病 率在發(fā)達國家超過細菌性痢疾，在發(fā)展中國家發(fā)病率幾乎等同于細菌性痢疾。本菌作為重 要的食源性致病菌，隨著食物進入腸道后在含微量氧環(huán)境下迅速繁殖，主要侵犯空腸、回腸 和結(jié)腸，侵襲腸粘膜，造成充血及出血性損傷，近年來觀察到有些菌株能產(chǎn)生類似霍亂腸毒 素，引起腸腔內(nèi)液體分泌增加。
[0003] 目前空腸彎曲菌的檢測主要依賴于國標所規(guī)定的生化鑒定，其缺點是操作繁瑣、 檢測周期較長，無法適應(yīng)大量的樣品篩查。免疫學檢測是近年來出現(xiàn)的最快速、準確、穩(wěn)定 的快速檢測手段，但國內(nèi)外目前尚無可運用于檢測實踐的快速檢測產(chǎn)品，該專利以空腸彎 曲菌為檢測靶標，所要求保護的技術(shù)涉及空腸彎曲菌快速檢測產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種檢測空腸彎曲菌的試劑盒。
[0005] 進而，本發(fā)明提供了一種用于檢測空腸彎曲菌的酶聯(lián)免疫試劑盒，所述的試劑盒 含有：
[0006] (a)固相載體，所述的固相載體上包被有作為捕捉抗體的抗空腸彎曲菌單克 隆抗體3G2D8H3G9，所述的抗空腸彎曲菌單克隆抗體3G2D8H3G9由小鼠雜交瘤細胞系 3G2D8H3G9,CGMCCNo. 8766 產(chǎn)生；
[0007] (b)容器a，所述的容器a中裝有作為檢測抗體的抗空腸彎曲菌單克隆抗體 4C9E1G7H3,所述的抗空腸彎曲菌單克隆抗體4C9E1G7H3由小鼠雜交瘤細胞系4C9E1G7H3， CGMCCNo. 8457 產(chǎn)生。
[0008] 在一優(yōu)選例中，所述的固相載體為酶標反應(yīng)板。
[0009] 在另一優(yōu)選例中，所述的檢測抗體帶有可檢測的標記物。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述的可檢測的標記物為辣根過氧化物酶。
[0011] 在另一優(yōu)選例中，所述的試劑盒還含有陽性對照和陰性對照。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述的陽性對照為滅活的空腸彎曲菌菌液，所述的陰性對照為 滅菌的布氏肉湯。
[0013] 本發(fā)明各個方面的細節(jié)將在隨后的章節(jié)中得以詳盡描述。通過下文以及權(quán)利要求 的描述，本發(fā)明的特點、目的和優(yōu)勢將更為明顯。
【附圖說明】
[0014] 圖1本發(fā)明的單克隆抗體的SDS-PAGE電泳圖
[0015] Lanel :4C9E1G7H3, Lane3 :3G2D8H3G9〇
【具體實施方式】
[0016] 本發(fā)明人的研究表明，以空腸彎曲菌作為免疫原，免疫Balb/c小鼠，分離純化得 到兩株抗空腸彎曲菌單克隆抗體，即3G2D8H3G9,保藏號CGMCCNo. 8766和4C9E1G7H3,保 藏號CGMCCNo. 8457,上述兩株單克隆抗體的抗體效價可達到1:100000,其能夠特異性、高 效地與空腸彎曲菌結(jié)合。以上述單克隆抗體3G2D8H3G9包被酶標反應(yīng)板作為捕捉抗體，用 辣根過氧化物酶標記的上述單克隆抗體4C9E1G7H3作為檢測抗體，制作酶聯(lián)免疫檢測試劑 盒。結(jié)果顯示，上述空腸彎曲菌檢測試劑盒檢測靈敏度達到10 5cfu/ml，具有重復性、準確性 好的優(yōu)點，孔間誤差小于5 %，板內(nèi)CV小于3 %。其與單增李斯特、豬霍亂沙門、鼠傷寒沙門、 腸炎沙門、福氏志賀、宋內(nèi)氏志賀、鮑氏志賀、出血性大腸桿菌0157:H7、阪崎腸桿菌、小腸耶 爾森氏菌等共計91種細菌均無交叉反應(yīng)。
[0017] 在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明人進而根據(jù)雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法，經(jīng)過反復測試，終于獲得 了一種可快速、高效檢測食源性空腸彎曲菌的酶聯(lián)免疫試劑盒。
[0018] 抗體
[0019] 本發(fā)明包括兩株抗空腸彎曲菌單克隆抗體。本發(fā)明的兩株抗空腸彎曲菌單克 隆抗體可以利用小鼠雜交瘤細胞系3G2D8H3G9(CGMCCNo. 8766)和小鼠雜交瘤細胞系 4C9E1G7H3(CGMCCNo. 8457)分別分泌產(chǎn)生。
[0020] 本發(fā)明包括具有抗空腸彎曲菌單克隆抗體3G2D8H3G9和4C9E1G7H3的相應(yīng)氨基酸 序列的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物。具體 地，本發(fā)明包括具有含超變區(qū)（互補決定區(qū)，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶 聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物（即免疫偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物），只要該超變區(qū)與本發(fā)明的輕鏈和 重鏈的超變區(qū)相同或至少90%同源性，較佳地至少95%同源性。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知， 免疫偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物包括：藥物、毒素、細胞因子（cytokine)、放射性核素、酶和其 他診斷或治療分子與抗空腸彎曲菌單克隆抗體或其片段結(jié)合的而形成的偶聯(lián)物。本發(fā)明還 包括與抗空腸彎曲菌單克隆抗體或其片段結(jié)合的細胞表面標記物或抗原。
[0021] 對于本發(fā)明的抗空腸彎曲菌單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可以用常規(guī)方法測定。 抗空腸彎曲菌單克隆抗體V鏈的超變區(qū)或互補決定區(qū)（complementaritydetermining region，⑶R)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結(jié)合抗原。因此，本發(fā)明包括那些 具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR與抗空腸彎曲菌單克隆抗 體⑶R具有90%以上（較佳地95%以上）的同源性。本發(fā)明不僅包括完整的單克隆抗體， 還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或（Fab'）2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈。
[0022] 本發(fā)明還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列可 以用常規(guī)技術(shù)，利用小鼠雜交瘤細胞系3G2D8H3G9(CGMCCNo. 8766)和4C9E1G7H3(CGMCC No. 8457)獲得。此外，還可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
[0023] -旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關(guān)序列。
[0024] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通 過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
[0025]目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白（或其片段，或其衍生 物）的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中己知的各種現(xiàn)有的DNA分子（或如載 體）和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
[0026] 本發(fā)明還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體。這 些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。
[0027] 宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如哺乳動物細胞。
[0028] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進行。當宿主為原 核生物如出血性大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaClJi 處理，所用的步驟在本領(lǐng)域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電 穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可運用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī) 機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。
[0029] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用 的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生