過碘酸-雪夫(pas)染色液(化學染色法)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體的說是涉及過碘酸-雪夫（PAS)染色液（化學染 色法），即一種過碘酸-雪夫化學染色試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 過碘酸-雪夫（PAS)染色是血細胞常用的化學染色方法之一，對于紅細胞系、白細 胞系、淋巴系統(tǒng)等某些血液病的診斷、鑒別診斷及療效觀察有著重要作用。其染色原理是： 細胞內(nèi)含乙二醇的糖類物質(zhì)能被過碘酸氧化，形成雙醛類物質(zhì)，后者與Schiff試劑中的無 色品紅結(jié)合，形成紫紅色沉淀物，沉淀物的顯色深淺與乙二醇的含量成正比。隨著醫(yī)學實驗 技術(shù)的發(fā)展，PAS應用的范圍更加廣泛，如用以證明與鑒別細胞內(nèi)空泡狀的性質(zhì)，心肌病變 及其他心血管疾病的診斷，糖原累積病診斷和研究，糖尿病的診斷和研究，用于某些腫瘤的 診斷等。
[0003] 隨著PAS的廣泛應用，市面上有許多商品化的PAS試劑盒出售，除用于糖原的鑒定 和糖類的顯示外，還可以觀察腎小球基底膜、結(jié)腸杯狀細胞中性黏液物質(zhì)、阿米巴滋養(yǎng)體和 霉菌的著色，為臨床診斷、分類和治療提供了重要的依據(jù)。市場上的PAS試劑盒主要有兩 種：a)PAS染色試劑盒：只含品紅染色劑的試劑盒，如sigma公司的PAS試劑盒；b)PAS聯(lián)合 染色試劑盒：此類試劑盒中含品紅和其他染料，如AB-PAS試劑盒，該試劑盒采用阿爾辛藍 和PAS技術(shù)聯(lián)合使用鑒別同一組織切片中的黏蛋白。
[0004]PAS染色是利用細胞化學顯示細胞內(nèi)糖類的技術(shù)，染色過程中細胞內(nèi)糖類物質(zhì)的 固定、糖類的氧化程度和Schiff試劑在染色過程中起到至關(guān)重要的作用。
[0005] 固定液不同，細胞染色效果會有差異，因此選擇合適的固定液至關(guān)重要。目前，血 片和骨髓涂片常用的固定液成分簡單，如95%乙醇和甲醇，固定過程會對細胞、組織結(jié)構(gòu)產(chǎn) 生影響，固定效果一般，固定時間較長，一般需要固定5-8min左右或更長。而固定效果相對 較好的Carnoy液和Rossman液等需要幾種試劑臨時配制，且操作程序繁瑣，而且兩者固定 時間更長，前者需要在15_20min或更長，后者則在室溫下需要24-36h，操作時間較長，不利 于檢測。
[0006]Schiff試劑為品紅醛試劑，由堿性品紅在酸性環(huán)境下與亞硫酸鹽作用，生成無 色品紅，是PAS染色的關(guān)鍵。目前，其主要配制方法為將堿性品紅用蒸餾水攪拌或加熱溶 解，鹽酸調(diào)節(jié)pH值后，再加入偏重亞硫酸鈉待紅色褪去，活性炭過濾，避光保存，如文獻 《Lyon'sPAS標準化染色方法與傳統(tǒng)PAS法的比較研究》（王正義，汪維偉，重慶醫(yī)科大學 學報2005年第30卷第5期）以及專利CN102243226A。市售PAS染色試劑盒中Schiff試 劑主要采用上述方法配制，在用于PAS染色時，對于含糖量低的細胞，靈敏度不高并且染色 效果不太理想，且與血細胞中糖原顯色常需要反應1小時以上，檢測頗為耗時。此外，現(xiàn)有 的PAS方法或者是市售的PAS試劑盒還存在假陰性高的缺陷。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供過碘酸-雪夫（PAS)染色液（化學染色法），即 過碘酸-雪夫化學染色試劑盒，使所述試劑盒應用于檢測時能夠縮短檢測時間，提高固定 染色效果，可用于血細胞內(nèi)糖類物質(zhì)染色。
[0008] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種過碘酸-雪夫染色試劑盒，使所述試劑盒應用 于檢測時能夠提尚檢測靈敏度。
[0009] 本發(fā)明的另一個目的在于提供一種過碘酸-雪夫染色試劑盒，使所述試劑盒應用 于檢測時能夠降低結(jié)果的假陰性率。
[0010] 為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0011] -種過碘酸-雪夫化學染色試劑盒，包括PAS固定液、PASI液、PASII液和PAS復染液；
[0012] 其中，所述PAS固定液由高錳酸鉀、甲醇和甲醛組成；所述PASI液為過碘酸溶 液；所述PASII液為Schi??試劑。
[0013] 針對現(xiàn)有PAS染色法中固定液時間過長、固定染色效果不佳的缺陷，本發(fā)明選擇 高錳酸鉀、甲醇和甲醛三種試劑共同作為固定液，本發(fā)明PAS固定液具有強穿透力、固定 時間快，細胞收縮小，對脂類、糖類、蛋白質(zhì)類等物質(zhì)都有很好的固定作用，能增強膜結(jié)構(gòu)反 差，可保存DNA和糖原，該固定液用于細胞固定，染色后顏色均勻鮮艷，結(jié)構(gòu)清晰。
[0014] 作為優(yōu)選，所述PAS固定液由0.25%高錳酸鉀、甲醇和40%甲醛組成。更優(yōu)選地， 所述0. 25%高錳酸鉀、甲醇和40%甲醛的體積比為0. 25%高錳酸鉀：甲醇：40%甲醛= 1:4:1〇
[0015] 作為優(yōu)選，試劑盒中所述過碘酸溶液的質(zhì)量百分比濃度為0. 5% -1. 5%。
[0016] 本發(fā)明試劑盒中的PAS復染液可根據(jù)實際復染需要選擇恰當?shù)娜疽?，其作用僅為 突出染色效果，如常用的蘇木素染液，故本發(fā)明試劑盒優(yōu)選蘇木素染液，更優(yōu)選地，蘇木素 染液為Mayer's蘇木素染液，染液按常規(guī)方法配制或通過市售購買即可。
[0017] 在現(xiàn)有的Schiff試劑配制過程中均是采用1N的HC1進行pH值調(diào)節(jié)，而經(jīng)過本 發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，在Schiff試劑配制過程中采用有機弱酸替代常規(guī)方法使用的鹽酸，制備的 堿性品紅溶液與糖被過碘酸氧化后形成的醛類物質(zhì)反應產(chǎn)生顏色的平衡時間只需要lOmin 左右，顯色時間短；同時在醛類物質(zhì)濃度較低時也能顯色，檢測靈敏度較高。因此本發(fā)明優(yōu) 選在Schiff試劑配制中采用有機弱酸調(diào)節(jié)pH值；更優(yōu)選地，所述Schiff試劑由以下方法 制備獲得：
[0018] 步驟1 :稱取堿性品紅加入煮沸的蒸餾水中，攪拌至品紅徹底溶化，溶液冷卻到 50°C過濾，濾液加入有機弱酸，冷卻過夜；
[0019] 步驟2 :用有機弱酸調(diào)pH，攪拌，持續(xù)滴加有機弱酸直至pH穩(wěn)定至2. 00±0. 20,然 后加入偏重亞硫酸鈉，攪拌溶解，于暗處靜置，加入活性炭攪拌，過濾，濾液置于冰箱密閉保 存，獲得Schiff試劑。
[0020] 在上述配制方法中，所述有機弱酸優(yōu)選為甲酸、乙酸、乙二酸、枸櫞酸中的一種或 兩種以上。
[0021 ] 對于堿性品紅、蒸餾水、偏重亞硫酸鈉、活性炭的使用量可參照常規(guī)方法中的使 用量即可，例如稱取lg堿性品紅，加入200mL的煮沸的蒸餾水，加入偏重亞硫酸鈉時為 1-1. 5g，活性炭用量為1-1. 5g。
[0022] 以本發(fā)明提供的試劑盒進行PAS染色時的步驟可參照如下：
[0023] 步驟1 :取干燥的新鮮血涂片標本，滴加PAS固定液5~8滴，蓋滿血膜即可，1分 鐘，水洗2_3次，待干。
[0024] 步驟2 :滴加PASI液10分鐘，水洗2-3次，待干。
[0025] 步驟3 :置入PASII液內(nèi)室溫暗處放置10分鐘，然后流水沖洗數(shù)分鐘。
[0026] 步驟4 :PAS復染液復染1-2分鐘，水洗待干，鏡檢。
[0027] 本發(fā)明以所述PAS固定液和常規(guī)的甲醇、95%乙醇、Carnoy液、Rossman液等為測 試對象，分別按照Lyon'sPAS標準化染色方法和本發(fā)明的染色方法進行固定染色，結(jié)果顯 示，使用本發(fā)明固定液按照Lyon'sPAS標準化染色方法染色，固定染色效果較優(yōu)；完全按 照本發(fā)明試劑盒進行PAS染色，效果在所有測試對象中最好。
[0028] 同時，和按照常規(guī)HC1配制而成的Schiff試劑進行對比測試時，本發(fā)明改用有機 弱酸配制的Schiff試劑檢測糖類物質(zhì)的靈敏度更高，最低濃度小于0.lmg/L。此外，本發(fā)明 試劑盒還同市售的PAS試劑盒進行整體對比，結(jié)果顯示，本發(fā)明固定液固定時間僅需lmin， 整體耗時22min左右，而市售PAS試劑盒固定時間需要5-8min，整體耗時80min左右，并且 本發(fā)明檢測結(jié)果的陽性率更加貼近真實結(jié)果，而現(xiàn)有PAS試劑盒假陰性率較高，準確率差。
[0029] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明試劑盒細胞固定時間短、糖原顆粒保存好，染色后顏色更 均勻鮮艷，結(jié)構(gòu)更清晰；檢測靈敏度高，顯色時間縮短，假陰性率低；整個檢測過程從固定、 氧化、Schiff反應到蘇木素染色可在半小時內(nèi)完成，具有快捷、便利的優(yōu)點。
[0030] 由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明調(diào)整固定液組成，由此縮短了樣品固定時間，提高了 樣品固定染色效果。在此基礎(chǔ)上，本發(fā)明進一步改進Schiff試劑的配制方式，達到靈敏度 提高的效果，進一步縮短了整個PAS檢測時間。同時本發(fā)明提供的試劑盒檢測結(jié)果更加準 確，有效降低了假陰性率結(jié)果的出現(xiàn)。
【具體實施方式】
[0031] 本發(fā)明實施例公開了一種過碘酸-雪夫染色試劑盒。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本 文內(nèi)容，適當改進工藝參數(shù)實現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù) 人員來說是顯而易見的