一種基于上轉(zhuǎn)換納米材料的雙酚a電致化學(xué)發(fā)光適配體傳感器的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明主要基于上轉(zhuǎn)換納米材料利用適配體傳感器對(duì)雙酚A進(jìn)行電致化學(xué)發(fā)光 檢測(cè)，屬于分析化學(xué)領(lǐng)域。特點(diǎn)在于上轉(zhuǎn)換材料在電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)中的應(yīng)用，以及為雙酚A 的超靈敏檢測(cè)提供一種新方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 納米材料具有很多優(yōu)良的特性，如小尺寸效應(yīng)、量子尺寸效應(yīng)、表面效應(yīng)以及宏 觀量子隧道和介電限域效應(yīng)等，使其在很多領(lǐng)域得到發(fā)展和改良。鑭系元素?fù)诫s的上轉(zhuǎn)換 納米材料也因其良好的光學(xué)特性和電學(xué)性質(zhì)而成為研究熱點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于各種生物分析 檢測(cè)中。
[0003] 適配體（Aptamer)，為一種特異性DNA或是RNA鏈，由指數(shù)富集配基的系統(tǒng)進(jìn)化技 術(shù)（SELEX)從人工合成的寡核苷酸文庫(kù)中篩選獲得的，能與DNA、RNA、蛋白質(zhì)以及其它小分 子物質(zhì)發(fā)生高特異性結(jié)合。適配體的識(shí)別功能與抗體相似，但與抗體相比，具有更多的優(yōu) 點(diǎn)：（1)可在體外篩選，（2)靶目標(biāo)分子范圍廣，無論是小分子，還是大分子，甚至是生物體 等都可以篩選得到它們的適配體；（3)分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、生物化學(xué)穩(wěn)定性好易于長(zhǎng)期保 存；(4)具有變性和復(fù)性的可逆性；(5)容易對(duì)其修飾和改造，且不影響它的生物活性；(6) 具有高特異性、高識(shí)別能力。因此適配體常被制成各種適配體傳感器。
[0004] 電致化學(xué)發(fā)光，也稱電化學(xué)發(fā)光（ECL)是將電化學(xué)手段與化學(xué)發(fā)光方法相結(jié)合的 一種技術(shù)，它是指通過電極對(duì)含有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的體系施加一定的電壓或通過一定的電 流，化學(xué)發(fā)光物質(zhì)發(fā)生電子轉(zhuǎn)移形成激發(fā)態(tài)分子，它們之間或它們與體系中其它外加共存 物質(zhì)之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光，或者化學(xué)發(fā)光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子直接在電極上發(fā) 生氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生的一種光輻射的現(xiàn)象。是指發(fā)光物質(zhì)在電極表面經(jīng)由電化學(xué)和化學(xué) 反應(yīng)后，形成高能的激發(fā)態(tài)，再經(jīng)弛豫而產(chǎn)生光的過程。由于發(fā)光過程是由電化學(xué)反應(yīng)激發(fā) 產(chǎn)生，由所施加的光電倍增管電壓控制，無需外界激發(fā)光源，所以具有可控性，低信號(hào)背景 和高靈敏度的特點(diǎn)。因此ECL方法將電化學(xué)分析與化學(xué)發(fā)光檢測(cè)相結(jié)合，廣泛用于臨床檢 驗(yàn)分析及環(huán)境毒素，農(nóng)藥殘留、病毒、免疫等科學(xué)試驗(yàn)的分析檢測(cè)中，并逐漸發(fā)展成為分析 化學(xué)的一個(gè)重要的分支。
[0005] 雙酚A(BisphenolA，BPA)學(xué)名2, 2-二（4-羥基苯基）丙烷，主要用于制備環(huán)氧 樹脂（約占65% )、聚碳酸酯、聚酯樹脂。BPA的鉀鹽或鈉鹽是生產(chǎn)聚砜的原料，少量用作橡 膠防老劑，BPA還可用作聚氯乙烯穩(wěn)定劑、塑料抗氧劑、紫外吸收劑、農(nóng)用殺蟲劑，甚至是油 漆、油墨的抗氧化劑和增塑劑。BPA是工業(yè)上合成聚碳酸酯、環(huán)氧樹脂、聚砜樹脂、聚苯醚樹 月旨、不飽和聚酯樹脂等多種高分子材料的有機(jī)化工原料，用它加工制成食品袋、飲料罐、塑 料及牙齒填充物等。從含有雙酚A產(chǎn)品中能濾出BPA，老化的塑料等聚合物中BPA的濾出率 增加了將近1000倍，這大大提高了有機(jī)生物體暴露在BPA的水平。大量的體外研究表明： BPA具有破壞甲狀腺激素作用的潛在能力，引起人類前列腺癌細(xì)胞的擴(kuò)散，還能在低劑量時(shí) 阻止睪丸激素的合成。人類長(zhǎng)期接觸BPA或其他人工雌性激素，會(huì)降低男子的精子數(shù)和提 高女子乳腺癌的可能性，接觸的越多，生殖系統(tǒng)畸變的可能性就越大。因此對(duì)ΒΡΑ的檢測(cè)就 顯得越加重要。本發(fā)明首次將上轉(zhuǎn)換納米材料與適配體結(jié)合應(yīng)用于雙酚Α的電致化學(xué)發(fā)光 檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明目的在于將上轉(zhuǎn)換納米材料與雙酚A適配體結(jié)合應(yīng)用于電致化學(xué)發(fā)光對(duì) 雙酚A進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的定量檢測(cè)，特別涉及上轉(zhuǎn)換材料與適配體結(jié)合在電致化學(xué)發(fā)光檢 測(cè)中的應(yīng)用。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0008] (1)油溶性上轉(zhuǎn)換納米材料的制備：將0. 3gNaOH，1. 5mL去離子水，5mL油 酸和10mL乙醇加入燒杯內(nèi)，快速攪拌混合。準(zhǔn)確量取0. 6mLMnCl2 (0. 5mol/L)，lmL Y(N03)3 · 6Η20(0· 5mol/L)，0· 9mLYb(N03)3 · 5H20 和 0·lmLEr(N03)3 · 5Η20(0· 2mol/L)逐滴 加入到上述均勻溶液中，劇烈攪拌混合。隨后，稱取0. 168gNaF(4mmol/L)用4mL去離子水 溶解，逐滴加入到混合溶液中，保持劇烈攪拌15min，將白色膠狀溶液轉(zhuǎn)移到100mL帶聚四 氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，200°C反應(yīng)8h。反應(yīng)結(jié)束后，取出反應(yīng)釜讓其在空氣中自然冷卻至 室溫，棄上清溶液獲得底部沉淀，用乙醇清洗三遍以除去油酸，油酸鈉和其他反應(yīng)試劑。最 后，在70°C下烘12h得到油相的Mn2+摻雜NaYF4:Yb，Er上轉(zhuǎn)換納米顆粒粉末。
[0009] (2)水溶性上轉(zhuǎn)換納米材料的制備：取30mg步驟⑴中制備的材料溶解于4mL氯 仿中，隨后逐滴加入到8mL含有200mg聚丙烯酸（PAA)的水溶液中，常溫下攪拌24h。最后， 經(jīng)反復(fù)離心和超純水清洗得到易溶于水由PAA包被的Mn2+摻雜NaYF4:Yb，Er上轉(zhuǎn)換納米顆 粒。
[0010] (3)合成巰基化雙酚A適配體和互補(bǔ)鏈：適配體序列為5'-SH-CCGGTGGGT GGTCAGGTGGGATAGCGTTCCGCGTATGGCCCAGCGCATCACGGGTTCGCACCA- 3'，互補(bǔ)鏈序列為 5'-biotin-CCCACCTGACCACCC-3' 。
[0011] ⑷互補(bǔ)鏈標(biāo)記上轉(zhuǎn)換材料：取5mg步驟⑵中制備的材料溶解于5mL PBS(10mM，pH8. 0)緩沖液中，然后加入 0. 4mLEDC(2mg/mL)和 0. 2mLNHS(2mg/mL)溶 液，37°C，搖床震蕩2h，隨后進(jìn)行離心、沉淀、清洗三次。再將所得材料重新溶解于5mL PBS(10mM，pH8.0)緩沖液中，然后加入200yL親和素（5.0mg/mL)溶液，37°C，搖床震蕩 2h，隨后進(jìn)行離心、沉淀、清洗三次。所得親和素化的材料與生物素化的雙酚A適配體互補(bǔ) 鏈混合，37°C，搖床震蕩2h，隨后進(jìn)行離心、沉淀、清洗三次得到最終標(biāo)記材料。
[0012] (5)裸玻碳電極的拋光與清洗：裸電極依次用粒徑為1. 0μπι、0. 3μπι、0. 05μπι的 氧化鋁粉末在麂皮上各打磨8min，每次換不同粒徑粉末之前都需將電極和麂皮上的殘余粉 漿沖洗干凈。打磨完畢后分別用超純水、無水乙醇、超純水對(duì)電極超聲5min，最后氮?dú)獯蹈?備用。
[0013] (6)裸玻碳電極的測(cè)試：稱取3. 73gKC1及0· 082gK3Fe(CN)6溶于50mL容量瓶 中，配成5mMFe(CN) 63和lmol/LKC1溶液；打磨洗好的電極為工作電極，銀/氯化銀為參 比電極，鉑絲為對(duì)電極組