一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]
本發(fā)明涉及生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及基于核酸適配體檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器，還涉及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]
沙門氏菌是腸桿菌科重要的食源性致病菌之一，在我國食物中毒病例中占有較高比率。鼠傷寒沙門氏菌因其耐藥性強(qiáng)、傳播途徑廣、侵染宿主多等特點(diǎn)，被廣泛關(guān)注。研究表明鼠傷寒沙門氏菌具有極強(qiáng)的多重耐藥性，對(duì)多數(shù)抗生素均表現(xiàn)出抵抗能力。調(diào)查中，鼠傷寒沙門氏菌感染數(shù)量占當(dāng)年沙門氏菌感染總量的17%。同時(shí)，在我國境內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的290余種沙門氏菌血清型中，鼠傷寒沙門氏菌也是最常見的血清型之一。
[0003]目前，主要用來檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法包括生化鑒定和血清分型。但此方法存在自身不可避免的缺點(diǎn)與限制，需經(jīng)過增菌培養(yǎng)、選擇篩選、生化鑒定、血清分型等流程，耗時(shí)一周左右，不利于快速、準(zhǔn)確地對(duì)食品中的鼠傷寒沙門氏菌進(jìn)行檢測。因此，有必要建立一種高效快速檢測鼠傷寒沙門氏菌的新方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]
為了解決檢測鼠傷寒沙門氏菌的方法中特異性和靈敏度都比較低、成本高的問題，本發(fā)明提供了一種特異性和靈敏度高、成本低、檢測速度快的基于核酸適配體檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器。使用本發(fā)明的生物傳感器，沙門氏菌檢測限可達(dá)1X10 16mol/mlo
[0005]本發(fā)明還提供了基于核酸適配體檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器的制備方法。
[0006]本發(fā)明中一共用到了4 條 DNA 鏈，分別是:HAP、padlock probe、ligat1n probe、capture probe0
[0007]其序列分別為:
HAP ?，-TCT TGC CTA CGT CAT TTT TTT TAG TAA TGC CCG GTA GTT ATT CAA AGA TGAGTA GGA AAA GAT AGG CAA GA-3，(SEQ ID NO:1);
padlock probe:5，-d_TGA CGT AGG CAA GAT AGA GGA GAC CCA GTA GCC AGA TGT AGCTTC GTA GGA CTT AAAGGT AGT TGG AGC TGT-3’ ( SEQ ID NO:2);
ligat1n probe:5’ -TCT TGC CTA CGT CAA CAG CTC CAA CTA CC-3’ ( SEQ ID NO:
3)
capture probe:5’ -GAG ACC CAG TAG CCA GAT GTA GCT-SH-3’ ( SEQ ID NO:4);HAP中，中間下劃線部分序列是適配體序列。
[0008]padlock probe:中間劃線部分與capture probe序列相同。
[0009]其中發(fā)夾結(jié)構(gòu)的序列HAP中，中間下劃線部分序列為目標(biāo)物鼠傷寒沙門氏菌的適配體，可以與目標(biāo)物特異性的識(shí)別并緊密結(jié)合。由于變形而暴露出的5’端下劃線部分為滾環(huán)復(fù)制的引物序列，可以與環(huán)中padlock probe中5’端下劃線部分結(jié)合，起始滾環(huán)復(fù)制過程。
[0010]padlock probe的5’端磷酸化，且下劃線部分的序列和3’端部分的序列分別與ligat1n probe的5’端和3’端互補(bǔ)，在T4 DNA連接酶的作用下可以連接成環(huán)。
[0011]capture probe的3’端修飾有巰基(_SH)，可以與金電極形成穩(wěn)定的Au_S鍵，從而將capture probe固定在電極表面，5’端含有與padlock probe環(huán)狀結(jié)構(gòu)內(nèi)部序列(加下劃線部分)相同的序列，能夠與滾環(huán)放大(Rolling Circle Amplificat1n, RCA)的產(chǎn)物結(jié)合，從而起到捕獲作用。
[0012]本發(fā)明中用到了兩種酶:Phi 29 DNA聚合酶和T4 DNA連接酶。Phi 29 DNA聚合酶同時(shí)具有鏈延伸和置換功能，T4 DNA連接酶催化相鄰DNA鏈的5’-P末端和3’-0H末端以磷酸二酯鍵結(jié)合的反應(yīng)，需ATP作輔酶。
[0013]本發(fā)明中鼠傷寒沙門氏菌的檢測是在均相溶液中實(shí)現(xiàn)的，通過滾環(huán)放大的方式來實(shí)現(xiàn)信號(hào)的放大，從而實(shí)現(xiàn)鼠傷寒沙門氏菌的高靈敏檢測，并獲得較低的檢測下限。
[0014]padlock probe在引物和T4 DNA連接酶的作用下完成成環(huán)反應(yīng)。發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA中有目標(biāo)物的適配體和RCA所需引物，在有目標(biāo)物存在的情況下，該適配體序列能夠特異性的識(shí)別目標(biāo)物并與之結(jié)合，發(fā)生構(gòu)型轉(zhuǎn)變，從而將發(fā)夾結(jié)構(gòu)的DNA鏈打開，同時(shí)暴露出引物序列。此時(shí)均相中的環(huán)狀結(jié)構(gòu)就可以與打開的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的引物端發(fā)生互補(bǔ)配對(duì)，從而將環(huán)狀結(jié)構(gòu)與HAP固定到一起。此時(shí)在Phi 29 DNA聚合酶與dNTP的共同作用下，以環(huán)狀結(jié)構(gòu)為模板、在引物作用下發(fā)生RCA反應(yīng)，得到大分子量的復(fù)制產(chǎn)物，即為RCA產(chǎn)物，而MB能夠結(jié)合到產(chǎn)物上，隨著RCA反應(yīng)的不斷進(jìn)行，結(jié)合到產(chǎn)物上的MB數(shù)量不斷增加，從而使信號(hào)放大。
[0015]在均相反應(yīng)中，成環(huán)反應(yīng)和RCA的反應(yīng)條件均為37°C，反應(yīng)時(shí)間是2 h。
[0016]一種檢測鼠傷寒沙門氏菌的生物傳感器，包括金電極，在金電極上從內(nèi)往外依次修飾有capture probe層和RCA產(chǎn)物層；
所述的生物傳感器，capture probe層的厚度為10±2 nm，RCA產(chǎn)物層的厚度為30±2
nmD
[0017]所述的生物傳感器的制備方法，包括以下步驟:
(1)對(duì)電極進(jìn)行預(yù)處理；
(2)將captureprobe層修飾到電極表面；
(3)將孵育好的混合溶液滴加到修飾好captureprobe層的電極上，37°C，孵育2 h。
[0018]所述的制備方法，優(yōu)選將capture probe層修飾到電極表面的操作步驟如下:將capture probe 10 μ L滴加到經(jīng)過預(yù)處理的電極表面，在25°C下孵育2 h。
[0019]所述的制備方法，操作步驟如下:
(1)將滅菌水，10X的buffer緩沖液、HAP和待測目標(biāo)物加入1號(hào)離心管中，震蕩30s，放入37°C的恒溫箱中孵育2h ;
(2)向2號(hào)離心管中加入padlockprobe、連接酶、ligat1n probe，震蕩30 s，放入37°C的恒溫箱中孵育2 h ;
(3)向1號(hào)離心管中加入第2步所得產(chǎn)物，聚合酶及dNTP，震蕩30s，放入37°C的恒溫箱中孵育2 h ;
(4)將孵育好的混合溶液滴加到修飾好captureprobe層的電極上，將電極繼續(xù)放在37°C的恒溫箱中孵育2 h，清洗；
(5)將電極插入到MB溶液中，37°C孵育10min，清洗；
所述的生物傳感器，HAP (摩爾)、padlock probe (摩爾)、ligat1n probe (摩爾)、聚合酶(活力)、連接酶(活力)和dNTP (活力)的摩爾與活性的比為1:1:1:2:40:2。
[0020]所述的制備方法，優(yōu)選對(duì)電極進(jìn)行預(yù)處理操作為電極在0.3和0.05 μπι的氧化鋁漿中進(jìn)行拋光處理，直到呈鏡面，用PBS和二次水沖洗。
[0021]該發(fā)明的檢測方式是電化學(xué)檢測，利用傳統(tǒng)的三電極體系。Ag/AgCl為參比電極，鈾絲為對(duì)電極，修飾的金電極為工作電極。在檢測之前，先通過Au-S鍵將capture probe固定到電極表面。然后將反應(yīng)后的均相溶液修飾到電極表面，然后在37°C孵育2h使均相中的RCA產(chǎn)物與電極表面的capture probe完成雜交反應(yīng)，從而將RCA產(chǎn)物固定到電極表面。然后用三電極工作體系檢測MB的氧化還原峰。以Ag/AgCl為參比電極，以Pt電極為對(duì)電極，電位設(shè)置為0到-0.5 V，脈沖寬度0.05 V，掃描速率為0.06 S，采用差分脈沖伏安技術(shù)讀取MB電信號(hào)的變化，檢測待測目標(biāo)物。
[0022]本發(fā)明基于核酸適配體與目標(biāo)物的特異性識(shí)別，具有鏈置換功能的DNA聚合酶的鏈延伸和置換作用，滾環(huán)放大作用以及亞甲基藍(lán)的氧化還原特性構(gòu)建了適體生物傳感器。該傳感器具有檢測速