一種水貂阿留申病毒抗體elisa快速檢測試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種水貂阿留申病毒抗體ELISA快速檢測試劑盒及其制備方法，屬于 免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 水貂阿留申是由水貂阿留申病毒引起的一種急性、進行性的傳染病。隨著時間的 延長，隱性變成顯性，給貂群造成嚴(yán)重?fù)p失，因此建立定期凈化制度是非常必要的。
[0003] 目前，水貂阿留申病毒抗體的檢測方法有雙流向電泳法和PCR法，雙流向電泳法 需要雙流向免疫電泳抗原，抗原必須在_20°C以下保存，保存期不足一年，保存條件苛刻，檢 測結(jié)果的假陽性較高；PCR法需要昂貴的PCR檢測儀，并且檢測時間長，3-5小時，并且需要 專業(yè)的技術(shù)人員操作，與水貂阿留申病雙流向電泳相比，本發(fā)明試劑盒可以快速、靈敏、準(zhǔn) 確的檢測水貂阿留申病毒抗體水平，保存期長，靈敏度更高；與PCR檢測試劑盒相比，此試 劑盒不需要阿貴的PCR儀，成本低，檢測時間短，易于操作。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種水貂阿留申病毒抗體ELISA快速檢測試劑盒及其制備方法，為 快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測水貂阿留申病毒抗體減少了時間和成本。
[0005] 本發(fā)明是通過下述的技術(shù)方案來實現(xiàn)的：
[0006] -種水貂阿留申病毒抗體ELISA快速檢測試劑盒的制備方法，包括以下步驟：
[0007] (1)阿留申病毒培養(yǎng)：
[0008] 將10日齡因阿留申病毒導(dǎo)致死亡的仔紹，取出睪丸和腎臟制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞密 度為1~5X104個/ml，37°C培養(yǎng)，營養(yǎng)液采用DMEM培育基（上海西寶生物科技有限公司， 型號為1?10-013-〇0，按01^1培育基的體積加入5%新生牛血清（天津康源生物技術(shù)有限 公司），細(xì)胞經(jīng)4天長成單層后，棄去營養(yǎng)液，加入除菌的連續(xù)通過貂體的第三代反應(yīng)毒， 接毒量為1 %，加入維持液，維持液采用不加血清的DMHM培養(yǎng)液，接毒后一周出現(xiàn)病變并收 集病毒，冷凍凍融三次待用；
[0009] (2)阿留申病毒純化：
[0010] 稱取凝膠干粉G-200 (上海弘順生物科技有限公司，型號為GR-F1031) 10-12克，緩 慢地倒入20倍凝膠體積的蒸餾水中，在室溫條件下浸泡三小時或在沸水中浸泡4-5小時， 輕輕攪拌，在室溫靜止30分鐘，將上層液體傾出，再用蒸餾水浮洗4次，然后裝柱加樣；收集 時將每管洗脫液依次排列，逐份用SPA菌體（+)血清試劑作特異性測定，根據(jù)特異性和峰值 收集，第一峰為純化的阿留申病毒蛋白，第二峰為非特異蛋白；經(jīng)sephadex-G200分離后， 將樣品裝入透析袋中、用聚乙二醇20000(濟南永泰化工有限公司）濃縮成要求的蛋白含 量、透析、平衡、分裝、4°C保存，即得純化的病毒抗原；
[0011] (3)兔抗水貂二抗的制備及酶標(biāo)二抗的制備
[0012] 將水貂血清用辛酸-硫酸銨法純化，將純化的血清與501佐劑按體積比1:0. 5-1. 5 的比例混合，優(yōu)選的體積比為1: 1，對2-3月齡新西蘭白兔進行免疫，腿部肌肉注射，lmg/ 只，以后每隔兩周免疫一次，免疫劑量、部位同上；5免后心臟采血，即得到兔抗水貂二抗， 然后用蛋白A柱純化兔血清，計算蛋白濃度，用過碘酸鈉氧化法制備酶標(biāo)二抗，具體步驟 如下：稱取l〇mg辣根過氧化物酶（Sigma公司，HRP)，溶于lmL純水中；加入lmL新鮮配制 的0. 06mol/L高碘酸鈉溶液（北京化學(xué)試劑公司），室溫避光攪拌30min;加入lmL溶解了 5mg純化后的兔抗水貂二抗的0.lmol/L碳酸鹽緩沖液，室溫避光輕攪2-3h;加新鮮配制的 0. 2mL5mg/mL硼氫化鈉（北京化學(xué)試劑公司），4°C放置2h，以穩(wěn)定結(jié)合物；再移入透析袋， 于pH為7. 2的PBS透析過夜，-20 °C保存?zhèn)溆茫?br>[0013] ⑷快速檢測試劑盒的制備
[0014] ①酶標(biāo)板的制備：
[0015] 在聚乙烯微孔板（上海生工）上預(yù)包被純化的病毒抗原，該包被使用pH為9. 6的 10mM碳酸鹽緩沖液（北京化學(xué)試劑公司），在4°C下包被過夜；然后使用PBST洗滌兩次， PBST為lOmMPBS+O. 05%Tween20,再加入封閉液，封閉液為10mMPBS+2%牛血清白蛋白， BSA，37°C封閉2小時，干燥后真空抽干包裝成成品試劑盒酶標(biāo)板；
[0016] ②試劑盒其他成分的配置：
[0017]A)酶標(biāo)二抗：用酶稀釋液（10mMPBS+1%牛血清白蛋白+0. 05%Tween20)配制成 1:500(V酶標(biāo)二抗:V酶稀釋液）的使用濃度；
[0018] B)樣品稀釋液：10mM PBS ;
[0019]C)陽性對照：10mMPBS+陽性血清；
[0020] D)陰性對照：10mMPBS+陰性血清；
[0021] E)顯示劑A液：0.5%過氧化物尿素+5mMPBS;
[0022] F)顯示劑B液：1 % 3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺+5mMPBS;
[0023]G)終止液：5mM硫酸；
[0024] H)20X濃縮洗滌液：1M PBS+0. 2% Tween20〇
[0025] 本發(fā)明的保護范圍還包括制備的水貂阿留申病毒抗體ELISA快速檢測試劑盒及 其應(yīng)用。
[0026] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點：
[0027] 本發(fā)明可以快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測水貂阿留申病毒抗體，克服了國內(nèi)檢測水貂阿 留申抗體主要以雙流向電泳法和PCR法的問題。
【具體實施方式】
[0028] 下面結(jié)合具體實施例來進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但實施例僅是范例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員 應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進行 修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。
[0029] 實施例1 一種水貂阿留申病毒抗體ELISA快速檢測試劑盒的制備方法，包括以下 步驟：
[0030] (1)阿留申病毒培養(yǎng)：
[0031] 將10日齡因阿留申病毒導(dǎo)致死亡的仔貂，取出睪丸和腎臟制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞密 度為1~5X104個/ml，37°C培養(yǎng)，營養(yǎng)液采用DMEM培育基（上海西寶生物科技有限公司， 型號為1?10-013-〇0，按01^1培育基的體積加入5%新生牛血清（天津康源生物技術(shù)有限 公司），細(xì)胞經(jīng)4天長成單層后，棄去營養(yǎng)液，加入除菌的連續(xù)通過貂體的第三代反應(yīng)毒， 接毒量為1 %，加入維持液，維持液采用不加血清的DMHM培養(yǎng)液，接毒后一周出現(xiàn)病變并收 集病毒，冷凍凍融三次待用；
[0032] (2)阿留申病毒純化：
[0033] 稱取凝膠干粉G-200(上海弘順生物科技有限公司，型號為GR-F1031) 10-12克，緩 慢地倒入20倍凝膠體積的蒸餾水中，在室溫條件下浸泡三小時或在沸水中浸泡4-5小時， 輕輕攪拌，在室溫靜止30分鐘，將上層液體傾出，再用蒸餾水浮洗4次，然后裝柱加樣；收集 時將每管洗脫液依次排列，逐份用SPA菌體（+)血清試劑作特異性測定，根據(jù)特異性和峰值 收集，第一峰為純化的阿留申病毒蛋白，第二峰為非特異蛋白；經(jīng)sephadex-G200分離后， 將樣品裝入透析袋中、用聚乙二醇20000(濟南永泰化工有限公司）濃縮成要求的蛋白含 量、透析、平衡、分裝、4°C保存，即得純化的病毒抗原；
[0034] (3)兔抗水貂二抗的制備及酶標(biāo)二抗的制備
[0035] 將水貂血清用辛酸-硫酸銨法純化，將純化血清與501佐劑按體積比1:0. 5-1. 5 的比例混合，對2-3月齡新西蘭白兔進行免疫，腿部肌肉注射，lmg/只，以后每隔兩周免疫 一次，免疫劑量、部位同上；5免后心臟采血，即得到兔抗水貂二抗，然后用蛋白A柱純化兔 血清，計算蛋白濃度，用過碘酸鈉氧化法制備酶標(biāo)二抗；
[0036] (4)快速檢測試劑盒的制備
[0037] ①酶標(biāo)板的制備：
[0038] 在聚乙烯微孔板（上海生工）上預(yù)包被純化的病毒抗原，該包被使用pH為9. 6的 10mM碳酸鹽緩沖液（北京化學(xué)試劑公司），在4°C下包被過夜；然后使用PBST洗滌兩次， PBST為lOmMPBS+O. 05%Tween20,再加入封閉液，封閉液為10mMPBS+2%牛血清白蛋白， BSA，37°C封閉2小時，