檢測辣椒中黃曲霉毒素b1的酶聯(lián)免疫試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及酶聯(lián)免疫檢測技術，具體設及一種用于檢測辣椒中黃曲霉毒素B1的 酶聯(lián)免疫試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 辣椒是中國很多地區(qū)的主要經(jīng)濟作物，因其營養(yǎng)豐富、口感極佳和飲食習慣，是餐 桌上最常見的主菜。干辣椒是由成熟的辣椒干制而成的一種重要調料，富含多種營養(yǎng)物質， 可制成辣椒油、辣椒醬、辣椒粉、食品添加劑，其在儲運和銷售等環(huán)節(jié)中，在溫度、濕度適宜 的環(huán)境條件下，極易滋生各種微生物，而使辣椒發(fā)霉變質，致使辣椒品質下降，其中W黃曲 霉毒素的污染和危害最為突出，嚴重制約了干辣椒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，造成重大經(jīng)濟損失。
[0003] 黃曲霉毒素（Aflatoxins，AFT)是一類化學結構類似的化合物，主要由黃曲霉 (aspergillusflavus)寄生曲霉（a.parasiti州S))產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，均為二氨巧喃香 豆素的衍生物，黃曲霉毒素（81、82、61、62)是一群結構相似，黃曲霉毒素81含有一個雙巧 喃環(huán)和一個氧雜糞鄰酬，前者為基本毒性結構，后者與致癌有關，黃曲霉毒素B1是毒性最 強的一種，可引起內臟器官的病變，給人類健康帶來極大威脅，其毒性是氯化鐘的10倍，祇 霜的68倍，因此受到世界各國的普遍關注，世界衛(wèi)生組織（WT0)的癌癥研究機構于1993年 將黃曲霉毒素劃定為I類致癌物質。
[0004] 目前，黃曲霉毒素B1的檢測方法主要有：免疫親和層析凈化高效液相色譜法、免 疫親和層析凈化巧光光度法、薄層色譜等多種檢測方法。免疫親和層析凈化高效液相色譜 法，樣品前處理過程較為復雜、耗時、需純化處理，檢測需要昂貴的實驗室大型試驗儀器和 設備，配備專業(yè)檢測人員進行試驗操作，難W滿足現(xiàn)場大規(guī)模檢測。免疫親和層析凈化巧光 光度法，樣品前處理過程較為復雜、耗時、需純化處理，檢測需要巧光光度計，難W滿足現(xiàn)場 檢測需要。薄層色譜法樣品前處理繁瑣，實驗過程復雜、耗時、準確性差，靈敏度低、特異性 不強，且對實驗操作人員危害較大。本發(fā)明建立的酶聯(lián)免疫法具有靈敏度高、特異性強，能 夠滿足現(xiàn)場大規(guī)模檢測的快速篩選檢驗的要求。

【發(fā)明內容】

[0005] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種檢測辣椒中黃曲霉毒素B1的酶聯(lián)免疫試 劑盒，本發(fā)明酶聯(lián)免疫試劑盒操作簡單，耗時少，能對辣椒及辣椒制品中黃曲霉毒素B1含 量進行快速檢測，特別適合現(xiàn)場大批量樣品的篩選檢測。
[0006] 本發(fā)明提供一種黃曲霉毒素B1單克隆抗體和生產(chǎn)制備運種單克隆抗體的方法。 黃曲霉毒素B1是小分子物質，只有免疫反應性，沒有免疫原性，不能誘發(fā)機體產(chǎn)生免疫應 答。對黃曲霉毒素B1分子進行結構改造，獲得黃曲霉毒素B1半抗原，從而制備特異性抗體。 黃曲霉毒素B1與鹽酸徑胺縮合反應，引入一個新的徑基，再與班巧酸酢反應得到具有簇基 的黃曲霉毒素B1半抗原（圖2)，該黃曲霉毒素B1半抗原與大分子載體蛋白偶聯(lián)得到黃曲 霉毒素B1完全抗原（免疫原或包被原）。
[0007] 前述載體蛋白可為卵清蛋白、牛血清蛋白、鼠血清蛋白常用載體蛋白。
[0008] 本發(fā)明采用混合酸酢法將黃曲霉毒素B1半抗原與載體蛋白偶聯(lián)，重點突出黃曲 霉毒素B1的特征結構，增加了黃曲霉毒素B1半抗原的免疫原性。經(jīng)測定本發(fā)明中黃曲霉 毒素B1與牛血清白蛋白的結合摩爾比為14-18:1，滿足抗體制備條件。
[0009] 所述黃曲霉毒素B1特異性抗體為黃曲霉毒素B1單克隆抗體，它們均是前述黃曲 霉毒素B1免疫原免疫動物制備得到的。
[0010] 所述黃曲霉毒素B1單克隆抗體優(yōu)選為黃曲霉毒素B1鼠單克隆抗體。
[0011] 本發(fā)明過程中原材料制備過程： 1.半抗原的合成 黃曲霉毒素B1半抗原合成技術路線如圖2。
[0012] 2.黃曲霉毒素B1抗體的制備 (1)免疫原制備 將黃曲霉毒素B1半抗原與載體蛋白采用混合酸酢法進行偶聯(lián)得到免疫原。
[0013] (2)黃曲霉毒素B1鼠單克隆抗體的制備 a)免疫：選取Ba化/c小鼠作為免疫動物，黃曲霉毒素B1半抗原與載體蛋白偶聯(lián)物為 免疫原，血清效價大于1 : 10000后，取脾臟進行細胞融合。
[0014]b)細胞融合與克隆化：取免疫Ba化/c小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合，篩選 細胞株，直到得到穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。
[001引 3.抗抗體的制備 羊抗鼠抗抗體是W羊作為免疫動物，W鼠源抗體為免疫原對無病菌體羊進行免疫，得 到羊抗鼠抗抗體； 4.本發(fā)明所提供的黃曲霉毒素B1檢測方法及其檢測試劑盒用于檢測辣椒黃曲霉毒素B1含量。
[0016] 所述試劑盒還包括黃曲霉毒素B1標準品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗涂液、 濃縮復溶液。
[0017] 所述黃曲霉毒素B1標準品溶液：6瓶，濃度分別為0,0. 02,0. 05,0. 15,0. 60和 1. 8μg/Lo
[0018] 所述酶標記物的標記酶為辣根過氧化物酶或堿性憐酸醋酶，其中優(yōu)選辣根過氧化 物酶；酶標記的羊抗鼠抗抗體是采用戊二醒法或過艦酸鋼法將標記酶與抗抗體進行偶聯(lián)得 到的。
[0019] 當標記酶為辣根過氧化物酶時，顯色劑由顯色液A液和顯色液B液組成，顯色液 A液為過氧化氨或過氧化脈，所述顯色液B液為鄰苯二胺或四甲基聯(lián)苯胺，終止液為1~ 2mol/L的硫酸或鹽酸緩沖液；當標記酶為堿性憐酸醋酶時，顯色液為對硝基憐酸鹽緩沖 液、終止液為1~2mol/L氨氧化鋼溶液。
[0020] 所述濃縮洗涂液為抑值為7. 2-7. 5、含有0. 8-1. 2 %吐溫-20、0. 3-0. 6%〇疊氮化 鋼，0. 1-0. 2mol/L的憐酸鹽緩沖液，所述百分比為重量體積比。
[0021] 所述濃縮復溶液為抑7. 5-7. 8,含有2-4 %酪蛋白，0. 1-0. 2mol/L的憐酸鹽緩沖 液，所述百分比為重量體積百分比。
[0022] 其中酶標板在制備過程中所用的包被緩沖液為抑值為9. 2-9. 6、0. 1-0. 2mol/L的 碳酸鹽緩沖液，所用封閉液為含有5-8%脫脂奶粉，抑值7. 2-7. 6、0. 1-0. 2mol/L的憐酸鹽 緩沖液，所述百分比為重量體積比。
[0023] 本發(fā)明中酶標板的制備過程為：用包被緩沖液將黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原、抗體或 抗抗體稀釋成0. 15-0. 25μg/ml，每孔加入100μ1，37°C溫育化或4°C過夜，傾去包被液，用 稀釋的濃縮洗涂液洗涂2次，每次30秒，甩掉孔中液體，W吸水紙吸除殘余水分后，向每孔 中加入200μ1封閉液，37°C溫育化，傾去孔內液體，干燥后用侶膜真空密封，4°C干燥處保 存?zhèn)溆谩?br>[0024] 5.本發(fā)明的檢測原理為： 當在酶標板上預包被黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原時，加入樣本溶液或標準品溶液后，再加 入黃曲霉毒素B1特異性抗體溶液，樣本中殘留的黃曲霉毒素B1藥物與酶標板上包被的黃 曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原競爭黃曲霉毒素B1特異性抗體，加入酶標記抗抗體進行放大作用，用 顯色液顯色，樣本吸光值與黃曲霉毒素B1藥物的含量呈負相關，與標準曲線比較即可得出 樣本中黃曲霉毒素B1的殘留量。同時根據(jù)酶標板上顏色的深淺，與系列濃度的黃曲霉毒素 B1標準品溶液顏色的比較可粗略判斷樣品中黃曲霉毒素B1殘留量的濃度范圍。
[00巧]當在酶標板上預包被黃曲霉毒素B1特異性抗體時，加入樣本溶液或標準品溶液 后，再加入酶標記黃曲霉毒素B1半抗原溶液，樣本中殘留的黃曲霉毒素B1藥物與酶標記抗 原競爭包被在酶標板上的黃曲霉毒素B1特異性抗體，用顯色液顯色，樣本吸光值與黃曲霉 毒素B1藥物的含量呈負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中黃曲霉毒素B1的殘留含量。 同時根據(jù)酶標板上顏色的深淺，與系列濃度的黃曲霉毒素B1標準品溶液顏色的比較可粗 略判斷樣品中黃曲霉毒素B1殘留量的濃度范圍。
[0026] 當在酶標板上預包被黃曲霉毒素B1偶聯(lián)抗原時，加入樣本溶液或標準品溶液后， 再加入酶標記黃曲霉毒素B