一種檢測(cè)肝吸蟲IgG4抗體的ELISA試劑盒及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物免疫檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種試劑盒及其制備方法，尤其設(shè) 及一種檢測(cè)肝吸蟲IgG4抗體的化ISA試劑盒及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肝吸蟲亦稱華支睪吸蟲，因其成蟲主要寄生于終宿主的肝膽管內(nèi)，故俗稱肝吸蟲。 成蟲主要寄生在人、犬、貓、豬等的肝膽管內(nèi)，成蟲浸出物及代謝產(chǎn)物中含有抗原成分，感 染人體后會(huì)誘發(fā)多種免疫病理反應(yīng)，在肝吸蟲病人血清中，IgG是最容易檢測(cè)到的特異性 抗體，宿主感染肝吸蟲后可誘發(fā)較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答，參與體液免疫的主要免疫球蛋白為 IgG，其水平與感染度呈正相關(guān)，也就是說肝吸蟲IgG抗體水平在一定程度上可反映病人感 染程度。在肝吸蟲病的診斷及流行病學(xué)研究等方面具有重要意義，可輔助診斷肝吸蟲感染 及篩查感染人群。而IgG4是肝吸蟲感染及治療評(píng)價(jià)更為特異的指標(biāo)。
[0003] 傳統(tǒng)上，用患者糞便中肝吸蟲蟲卵的病原學(xué)方法檢測(cè)肝吸蟲病；近年來(lái)，免疫檢 測(cè)的方法逐漸被用于肝吸蟲病的臨床診斷研究中來(lái)，并取得了良好的效果。目前實(shí)驗(yàn)室和 臨床應(yīng)用的免疫學(xué)診斷方法主要有皮內(nèi)試驗(yàn)（ID)、間接血凝試驗(yàn)（IHA)、免疫酶染色試驗(yàn) (IEST)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)巧LISA)、間接巧光抗體試驗(yàn)（IFAT)、酶聯(lián)免疫印潰技術(shù)巧LIB) AfrAfr寸寸ο
[0004] CN103376314A公開了一種肝吸蟲IgG抗體酶聯(lián)免疫試劑盒，包括肝吸蟲可溶性 抗原標(biāo)準(zhǔn)液、肝吸蟲IgG抗體、酶標(biāo)板、酶結(jié)合物、底物顯色液、稀釋液、洗涂液和終止液；所 述肝吸蟲可溶性抗原由感染肝吸蟲病人血清中分離純化而得。CN102830231A公開了一種 基于檢測(cè)抗肝吸蟲抗原特異性抗體IgG4的肝吸蟲感染檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法，可W區(qū)分 肝吸蟲感染患者與非肝吸蟲感染患者，該試劑盒W肝吸蟲抗原特異性IgG4為檢測(cè)祀標(biāo)，提 高肝吸蟲病檢測(cè)方法的特異性。但是運(yùn)些方法都費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，樣本不易保存及運(yùn)輸，每次采 集的樣本檢測(cè)結(jié)果差異較大，操作繁瑣，不利于疾控部口及醫(yī)療機(jī)構(gòu)進(jìn)行批量操作，肝吸蟲 蟲卵較小，漏檢率高，而且不能對(duì)該病做出早期診斷，不利于臨床單位的推廣應(yīng)用。酶聯(lián)免 疫吸附試驗(yàn)巧LISA)及其他免疫檢測(cè)的方法在一定程度上解決了病原學(xué)方法檢測(cè)費(fèi)時(shí)、費(fèi) 力、漏檢率高的缺點(diǎn)，但目前均使用天然蟲卵抗原提取物作為試劑盒包被抗原，天然抗原存 在批間差異大、純化后雜質(zhì)較多、含有有效抗原成份不多等缺陷，容易造成試劑盒特異性較 差、靈敏度較低、批間差異大等質(zhì)量問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)肝吸蟲IgG4抗體的化ISA試劑盒及其制備方法， 該試劑盒具有高靈敏度、高特異性、省時(shí)的特點(diǎn)，用于肝吸蟲IgG4抗體的批量檢測(cè)。
[0006] 為達(dá)到此發(fā)明的目的，本發(fā)明采用W下技術(shù)方案：
[0007] 第一方面，本發(fā)明提供了一種檢測(cè)肝吸蟲IgG4抗體的化ISA試劑盒，其特征在于， 所述試劑盒包括：酶標(biāo)板和酶標(biāo)檢測(cè)抗體；
[0008] 其中，所述酶標(biāo)板上包被有肝吸蟲的特異性抗原CsSP46,所述特異性抗原CsSP46 的氨基酸序列包含如SEQIDNO. 1所示的片段，所述酶標(biāo)檢測(cè)抗體為酶標(biāo)記的抗人IgG二 抗或抗人IgG4二抗；
[0009] 所述SEQIDNO. 1所示的片段序列如下：
[0011] 作為試劑盒，酶標(biāo)板和酶標(biāo)檢測(cè)抗體是其核屯、成分，只要有運(yùn)兩種成分就能實(shí)現(xiàn) 基本的抗原-抗體結(jié)合反應(yīng)。至于輔助成分，比如樣品稀釋液、洗涂液、酶底物溶液、終止 液、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，可W與上述Ξ種成分配套組裝在一個(gè)試劑盒中，也可W單獨(dú)提 供，因此本發(fā)明中試劑盒可W包括運(yùn)些輔助成分，也可W不包括，本發(fā)明優(yōu)選包括運(yùn)些輔助 成分，W方便使用。
[0012] 本發(fā)明中，通過肝吸蟲現(xiàn)有基因數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)掘了一個(gè)特有的經(jīng)非經(jīng)典途徑分泌的 堿性蛋白CsSP46,通過基因工程手段從肝吸蟲的基因序列中獲得，作為一種特異性抗原，可 作為肝吸蟲病檢測(cè)的特異性包被抗原，相比于直接用從感染肝吸蟲病人血清中純化的肝吸 蟲抗原，專一性更強(qiáng)，效果更好；本發(fā)明首選肝吸蟲所特有的抗原性指數(shù)高的分泌抗原，W 提高其診斷的特異性和敏感性。
[001引優(yōu)選地，所述特異性抗原CsSP46的基因序列包含如SEQIDNO. 2所示的片段，所 述片段的序列如下：
[0015] 優(yōu)選地，所述酶標(biāo)檢測(cè)抗體為用辣根過氧化物酶或堿性憐酸酶標(biāo)記的抗人IgG二 抗或抗人IgG4二抗，優(yōu)選為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG二抗或抗人IgG4二抗；進(jìn)一步 優(yōu)選為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG4二抗。
[0016] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括樣品稀釋液、洗涂液和終止液。
[0017] 優(yōu)選地，所述樣品稀釋液為0. 006-0. 015mol/L的抑為6-6. 5的不含蛋白的憐酸 吐溫緩沖液；優(yōu)選為0.Olmol/L的抑為6. 35的不含蛋白的憐酸吐溫緩沖液。
[0018] 優(yōu)選地，所述洗涂液為濃縮洗涂液，優(yōu)選為含Tween-20的憐酸鹽緩沖液。
[0019] 優(yōu)選地，所述終止液為硫酸溶液。
[0020] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括酶底物溶液。
[0021] 優(yōu)選地，所述酶底物溶液包括顯色液A和顯色液B。
[0022] 優(yōu)選地，所述顯色液A為過氧化脈、巧樣酸、憐酸氨二鋼和吐溫20的混合液。
[0023]優(yōu)選地，所述顯色液B為3, 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺和巧樣酸的混合液。
[0024] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
[0025] 優(yōu)選地，所述陽(yáng)性對(duì)照為肝吸蟲IgG抗體陽(yáng)性對(duì)照。
[0026] 優(yōu)選地，所述陰性對(duì)照為肝吸蟲IgG抗體陰性對(duì)照。
[0027] 第二方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的檢測(cè)肝吸蟲IgG4抗體的化ISA試劑 盒的制備方法，所述方法包括W下步驟：
[0028] (1)通過基因工程手段獲得CsSP46特異性抗原；
[0029] (2)用所述特異性抗原CsSP46包被空白酶標(biāo)板，得到包被的酶標(biāo)板；
[0030] (3)將所述包被的酶標(biāo)板與酶標(biāo)檢測(cè)抗體組合成試劑盒；
[0031] 任選地，還包括將樣品稀釋液、洗涂液、酶底物溶液、終止液、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照 組合到試劑盒中。
[0032] 優(yōu)選地，所述步驟（1)具體包括：
[0033] (a)通過PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得所述CsSP46的基因序列，并將CsSP46的基因序列重組 到表達(dá)載體中，構(gòu)建重組載體；
[0034] 化）將重組載體轉(zhuǎn)化到克隆菌種，篩選含有所述CsSP46基因序列的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌；
[0035] (C)從所述陽(yáng)性轉(zhuǎn)化菌中提取所述重組載體，并轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌中，得到含有所述 CsSP46基因序列的陽(yáng)性表達(dá)菌，對(duì)所述陽(yáng)性表達(dá)菌擴(kuò)大培養(yǎng)，誘導(dǎo)所述CsSP46蛋白表達(dá)；
[0036] (d)親和層析純化所述CsSP46蛋白。
[0037] 本發(fā)明的CsSP46蛋白可W通過在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)得到，也可W通過常規(guī)膚合 成技術(shù)化學(xué)合成得到，優(yōu)選的是在適當(dāng)?shù)乃拗髦斜磉_(dá)得到。
[0038] 第Ξ方面，本發(fā)明提供一種如第一方面所述的檢測(cè)肝吸蟲IgG4抗體的化ISA試劑 盒的使用方法，所述使用方法包括如下步驟：
[0039] (1)試劑盒在室溫平衡30min，濃縮洗涂液用蒸饋水或去離子水進(jìn)行20倍稀釋，得 稀釋洗涂液；
[0040] 似加樣：取包被了肝吸蟲特異性重組抗原CsSP46的酶標(biāo)板，檢測(cè)孔加入100μL 樣品稀釋液，再加入10μL待測(cè)血清，對(duì)照孔分別直接加入相應(yīng)的對(duì)照樣本，在37°C下避光 反應(yīng)30min;
[0041] (3)洗板：兩點(diǎn)吸液，浸泡式洗涂5次，浸泡時(shí)間為60秒，洗完后扣干；
[004引 （4)除空白對(duì)照孔外，每孔加酶結(jié)合物lOOyL，振蕩均勻，置37°C下避光反應(yīng) 20min，按步驟3洗板并扣干；
[0043] (5)顯色：每孔加顯色液A和顯色液B各50μ以振蕩混勻，置37°C下避光顯色 lOmin；
[0044] (6)測(cè)定：每孔加終止液50μL，振蕩混勻后，W空白對(duì)照孔調(diào)零，在450nm波長(zhǎng) 化30nm作參比波長(zhǎng)）讀數(shù)。
[0045] 優(yōu)選地，所述讀數(shù)后的結(jié)果判定為
[004引 （1)有效性判定：
[0047] 空白對(duì)照孔0D值< 0. 05,若大于0. 05,則實(shí)驗(yàn)無(wú)效；
[004引陰性對(duì)照孔0D值《0. 10,若有1孔陰性對(duì)照孔0D值大于0. 10則應(yīng)舍去，若兩孔 陰性對(duì)照0D值大于0. 10,應(yīng)重復(fù)試驗(yàn)；
[0049] 陽(yáng)性對(duì)照孔0D值> 0. 5,若小于0. 5,則實(shí)驗(yàn)無(wú)效；
[0050] 0)結(jié)果判定：
[005U臨界值（COV)為 0. 12 ;
[005引樣本0D值>COV值時(shí)，判為肝吸蟲抗體陽(yáng)性；
[005引樣本0D值<COV值時(shí)，判為肝吸蟲抗體陰性。
[0054] 本發(fā)明中，所述COV是通過700份真陰性人血清樣本進(jìn)行測(cè)試，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì) 算，對(duì)于正態(tài)分布，均可按正態(tài)曲線下面積與"平均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差"的對(duì)應(yīng)關(guān)系估計(jì)正常值范 圍，即X+μδ。式中X為均數(shù)，μ為常數(shù)，δ為標(biāo)準(zhǔn)差。當(dāng)正常值范圍為95%時(shí)，單側(cè)μ 值為2. 0,因此確定臨界值的粗略計(jì)算公式為如下模式：COV=η+陰性對(duì)照平均0D值。η為 常數(shù)，即μδ值。該700份真陰性人血清樣本0D均值為0.05,標(biāo)準(zhǔn)差δ為0.035,計(jì)算得 出C0V值為0. 12。
[0055] 本發(fā)明試劑盒的檢測(cè)分析原理：
[0056] 本產(chǎn)品采用的是