為：蛋白腺15g/ 以玉米漿15g/l，葡萄糖15g/l，黃豆粉4g/l，氯化鋼5g/l，憐酸二氨鐘2g/l，pH7.2， 搖床轉速為280r/min，29°C培養(yǎng)7化后種入發(fā)酵培養(yǎng)基，搖床轉速為280r/min，29°C培養(yǎng) 4化后，補入維生素化，使得維生素化在發(fā)酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)72h，停止 發(fā)酵，測定發(fā)酵效價，與出發(fā)菌株相比，自養(yǎng)假諾卡氏菌突變株相對效價分布情況見表3,挑 選出發(fā)酵效價較高的菌株20支進行復篩。
[0040] 表3自養(yǎng)假諾卡氏菌突變株相對效價分布
從表3可知，采用該模型進行篩選，獲得自養(yǎng)假諾卡氏菌正突變的比例較高，達到 33. 3% 復篩：將挑選出的效價較高的20支菌株接種到種子培養(yǎng)基，搖床轉速為280r/min， 29°C培養(yǎng)7化后種入發(fā)酵培養(yǎng)基中，搖床轉速為280r/min，29°C培養(yǎng)4化后，補入維生素 化，使得維生素化在發(fā)酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)72h，停止發(fā)酵，測定發(fā)酵效 價，挑選出效價最高的菌株1支，保存，備用。
[0041] 發(fā)酵培養(yǎng)基試驗：將效價最高的菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)基試驗。按如下配方配制種子 培養(yǎng)基100mL:蛋白腺15g/L玉米漿15g/L葡萄糖15g/L黃豆粉4g/L氯化鋼5g/ L憐酸二氨鐘2g/L，pH7. 2。將種子培養(yǎng)基裝入3個250mlS角瓶中，每瓶30ml。滅菌后， 從斜面菌株挖塊接入種子培養(yǎng)基中，29°C培養(yǎng)72h，將種子液分別接入含有不同濃度聚山梨 醋-80的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵試驗，接種量為10% (V/V)。
[0042] 按照如下配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白腺15g/l，玉米漿15g/l，葡萄糖15旨/1，黃 豆粉4g/l，氯化鋼5g/l，憐酸二氨鐘2g/l，倍他環(huán)糊精3邑/1，聚山梨醋-80 1.0、2.0、 3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0、9. 0g/L，抑7. 2。搖床轉速為 280r/min，29°C培養(yǎng) 4她后，補 入維生素化，使得維生素化在發(fā)酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)3天，停止發(fā)酵，測 定發(fā)酵效價，所對應的測定結果見表4。
[0043]HPLC方法：色譜柱為Kromasil正相硅膠柱（250X4. 6mmi.d，5um)，流動相為異丙 醇-正己燒（1 : 9)，流速1.5ml/min，柱溫為40°C，檢測波長265皿。
[0044] 對含有不同聚山梨醋-80濃度的培養(yǎng)基進行綜合比較，篩選出最佳發(fā)酵配方。
[0045] 表4實驗測定結果
從表4中可W看出，配方中聚山梨醋-80的濃度在3-8g/L時，25徑基維生素化的效價 較高，7g/L時25徑基維生素化效價最高。
【主權項】
1. 篩選25羥基維生素D3高產(chǎn)菌株的方法，包括如下步驟： (1) 初篩：將誘變處理的自養(yǎng)假諾卡氏菌單孢子懸浮液稀釋后涂布于含有聚山梨 酯-80含量為15-20g/L的分離培養(yǎng)基做成的若干平板上，在29°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)144-192h， 從若干平板中挑選生長和產(chǎn)孢良好的菌株接種于斜面培養(yǎng)基制成的若干斜面上，在29°C 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)168h，斜面成熟后挖塊種入三角瓶中的種子培養(yǎng)基中，同時將用于誘變處理 的出發(fā)菌株斜面也挖塊種入三角瓶中的種子培養(yǎng)基中，作為對照，搖床轉速為280r/min， 29°C培養(yǎng)72h后，種入發(fā)酵培養(yǎng)基，將三角瓶置于搖床上，搖床轉速為280r/min，29°C培養(yǎng) 48h后，補入維生素D3，使得維生素％在發(fā)酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)72h，停止 發(fā)酵，測定兩種菌的發(fā)酵效價，與出發(fā)菌株相比，選出自養(yǎng)假諾卡氏菌突變株相對發(fā)酵效價 較高的菌株若干支進行復篩， (2) 復篩：將發(fā)酵效價較高的若干菌株接種于若干三角瓶中的種子培養(yǎng)基中，將三角瓶 置于搖床上，搖床轉速為280r/min，29°C培養(yǎng)72h后接種于若干個三角瓶中的發(fā)酵培養(yǎng) 基中，將三角瓶置于搖床上，搖床轉速為280r/min，29°C培養(yǎng)48h后，補入維生素D3，使得 維生素％在發(fā)酵液中的終濃度為500ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)72h，停止發(fā)酵，測定若干個三角瓶中 的發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵效價，挑選出一個三角瓶中發(fā)酵效價最高的一支菌株為最終產(chǎn)品。 2. 25羥基維生素D3高產(chǎn)菌株生產(chǎn)25羥基維生素D3的發(fā)酵培養(yǎng)基中聚山梨酯-80含量 的篩選方法，其特征在于將種子培養(yǎng)基裝入3個250ml三角瓶中，每瓶30ml，滅菌后，從25 羥基維生素D3高產(chǎn)菌株的斜面挖塊接入3個三角瓶種子培養(yǎng)基中，將三角瓶置于搖床上， 搖床轉速為280r/min，29°C培養(yǎng)72h，將3個三角瓶中的種子液分別移入含有不同含量聚 山梨酯-80的若干個三角瓶中的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵試驗，將三角瓶置于搖床上，搖床 轉速為280r/min，29°C培養(yǎng)48h后，補入維生素D3，使得維生素03在發(fā)酵液中的終濃度為 500ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)3天，停止發(fā)酵，測定發(fā)酵效價，確定一個三角瓶中的發(fā)酵效價最高的 發(fā)酵培養(yǎng)基，其聚山梨酯-80的含量為最佳值。3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟（1)中所述分離培養(yǎng)基成分和 含量為：葡萄糖15 g/L，蛋白胨10 g/L，玉米漿3 g/L，氯化鈉4 g/L，瓊脂15 g/L，聚山梨 酯-80 15 g/L，ρΗ7·0。4.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于所述的步驟（1)中所述斜面培養(yǎng)基成分和 含量為：葡萄糖15 g/L，蛋白胨10 g/L，玉米漿3 g/L，氯化鈉4 g/L，瓊脂15 g/L，ρΗ7.0。5.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的種子培養(yǎng)基成分和含量為：蛋 白胨15 g/L，玉米漿15 g/L，葡萄糖15 g/L，黃豆粉4 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/ L，ρΗ7· 2〇6.根據(jù)權利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的含聚山梨酯-80量不同的發(fā)酵 培養(yǎng)基，聚山梨酯-80含量分別為1-9 g/L中之一，其他成分和含量均為：蛋白胨15 g/L， 玉米漿15 g/L，葡萄糖15 g/L，黃豆粉4 g/L，氯化鈉5 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，倍他環(huán)糊精 3 g/L, pH7. 2〇7. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)中所述誘變處理為將出發(fā)菌株自 養(yǎng)假諾卡氏菌成熟斜面用生理鹽水制成單孢子懸液，經(jīng)振蕩，玻璃珠分散30min，無菌過濾 收集單孢子懸液約l〇ml于無菌培養(yǎng)皿中，使其孢子的終濃度達到120-130個/ml，紫外功率 30W，燈距25cm照射30s〇8. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于步驟（1)中所述誘變處理為將出發(fā)菌株 自養(yǎng)假諾卡氏菌成熟斜面用pH7. 0的磷酸鈉緩沖液成單孢子懸液，經(jīng)振蕩，玻璃珠分散 30min，無菌過濾收集單孢子懸液約10ml，使其孢子的終濃度達到120-130個/ml，加入烷 化劑甲基磺酸乙酯EMS，終濃度為3%，振蕩處理30min，加入硫代硫酸鈉終止反應，振蕩 20min〇9. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其特征在于發(fā)酵培養(yǎng)基中聚山梨酯-80的含量為3 -8 g/L〇
【專利摘要】本發(fā)明為篩選25羥基維生素D3高產(chǎn)菌株和發(fā)酵培養(yǎng)基中聚山梨酯-80含量的方法，解決誘變育種正突變率低，篩選工作量大，費時費力，從而不易篩選到高產(chǎn)菌株的問題。將能夠改變25羥基維生素D3產(chǎn)生菌自養(yǎng)假諾卡氏菌細胞膜通透性的物質聚山梨酯-80加入到分離培養(yǎng)基中，觀察菌株對聚山梨酯-80的耐受情況，確定其最低耐受劑量，選用出發(fā)菌株在高濃度下不能生長的聚山梨酯-80的量，作為篩選模型。經(jīng)過誘變后的自養(yǎng)假諾卡氏菌菌種，用所建立的篩選模型進行篩選。
【IPC分類】C12N15/01, C12R1/01, C12P7/02
【公開號】CN105296464
【申請?zhí)枴緾N201510825931
【發(fā)明人】曾志剛, 梁彥明
【申請人】曾志剛, 梁彥明
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月25日