一種血紅蛋白類載氧藥物中總磷脂含量的測定方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種血紅蛋白類載氧藥物中總磷脂含量的測 定方法。
【背景技術】
[0002] 磷脂（Phospholipid)也稱磷脂類、磷脂質(zhì)，是指含有磷酸的脂類，屬于復合脂。磷 脂組成生物膜的主要成分，分為甘油磷脂與鞘磷脂兩大類，分別由甘油和鞘氨醇構成。磷 脂為兩性分子，一端為親水的含氮或磷的頭，另一端為疏水(親油）的長烴基鏈。由于此原 因，磷脂分子親水端相互靠近，疏水端相互靠近，常與蛋白質(zhì)、糖脂、膽固醇等其它分子共同 構成脂雙分子層，即細胞膜的結(jié)構。目前，人紅細胞膜磷脂研究結(jié)果目前較為成熟，其中含 量分析結(jié)果可以參考文獻（參考 Virtanen JA, Cheng KH, Somerharju P. Phospholipid composition of the mammalian red cell membrane can be rationalized by a superlattice model. Proc Natl Acad Sci USA. 1998 Apr 28; 95 (9) : 4964-9. )〇 人紅細胞膜磷脂，其主要成份主要是：磷脂酰膽堿（Phosphatidylcholine)、鞘磷 脂（Sphingomyelin)、磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylethanolamine)、磷脂酰絲氨酸 (Phosphatidylserine)，這四種磷脂約占人紅細胞膜磷脂97. 3%。
[0003] 作為新型血紅蛋白類攜氧載氧體，人(動物）血液來源血紅蛋白類攜氧藥物總 磷脂定量是質(zhì)量控制關鍵指標之一。目前研究表明紅細胞膜磷脂具有較復雜的生理功 能，如果殘余磷脂含量超標，其輸注含量過高，有可能會引起輸注時候的生物毒性，研 究表明（參考 Feola M, Simoni J, Canizaro PC, Tran R, Raschbaum G, Behai FJ. Toxicity of polymerized hemoglobin solutions. Surg Gynecol Obstet. 1988 Mar; 166(3) :211-22.)，以四種牛聚合血紅蛋白和兔子血漿作為輸注液體，給失血三分之一的 5組兔子作為換血模型動物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)存在磷脂乙醇胺和磷脂絲氨酸組，內(nèi)毒素組以及超 大聚合分子量組的輸注液體，對換血模型造成提供了 33%的致死率，引起血液動力學不穩(wěn) 定，呼吸和腎代謝不充分，提供肝臟代謝酶水平，血小板減少，白細胞減少，彌散性血管內(nèi)凝 血及激活備用補體激活通路；激活實驗動物血液中的補體通路(參考Feola M，Simoni J， Dobke M, Canizaro PC. Complement activation and the toxicity of stroma-free hemoglobin solutions in primates. Circ Shock. 1988 Aug; 25 (4) : 275-90.);引起血 管性收縮和激活血液凝血通路，從而引起血液系統(tǒng)的混亂(參考Feola M，Simoni J，Tran R, Lox CD, Canizaro PC. Toxic factors in the red blood cell membrane. J Trauma. 1989 Aug; 29(8):1065-75.)。因此，必須建立一種快速、靈敏度高的血紅蛋白類載氧藥物 中總磷脂含量檢測方法。
[0004] 目前文獻報道的方法多用高效液相色譜法（HPLC)通過蒸發(fā)光散射檢測 器（ELSD)測定單一磷脂含量（參考 Rabinovich-Guilatt L, Dubernet C, Gaudin K,etal. Phospholipid hydrolysis in a pharmaceutical emulsion assessed by physicochemical parameters and a new analytical method. Eur J Pharm Biopharm. 2005 S印;61 (1-2) :69-76.)。其缺點是不能快速檢測血紅蛋白類載氧藥物總磷脂的含量， 必須通過多次實驗分別檢測單一磷脂含量，最后加和成總磷脂含量。這樣操作繁復、而且檢 測靈敏度達不到要求，必須要對檢測樣品進行一定富集。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了解決現(xiàn)有技術存在的上述問題，本發(fā)明提供了一種血紅蛋白類載氧藥物中總 磷脂含量的測定方法，以代替現(xiàn)有的HPLC方法，實現(xiàn)簡單、快速、靈敏地測定血紅蛋白類載 氧藥物中總磷脂含量。
[0006] 本發(fā)明所采用的技術方案為： 一種血紅蛋白類載氧藥物中總磷脂含量的測定方法，包括以下步驟： A.精確量取供試樣品適量于玻璃試管內(nèi)，待供試樣品中的有機溶劑揮發(fā)完全后，加入 適量優(yōu)級純高氯酸進行消解反應，將樣品中的總磷脂轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機磷，待消解完全后，得消解 液；取適量所述消解液并加入適量的純化水及所述無機磷顯色液反應完全，得到反應液，通 過紫外分光光度計測定所述反應液以及作為空白的相應溶劑的吸光度。
[0007] B.樣品中總磷脂含量的計算：取磷酸二氫鉀標準液稀釋成不同的濃度作為外標 標準液，并以紫外分光光度計測得的各外標標準液的吸光度制作外標標準曲線，以步驟A 中測得的所述反應液液的吸光度對照外標標準曲線計算出Iml所述反應液中的無機磷含 量，根據(jù)下列公式I計算出樣品中總磷脂的測定含量； 取適量磷脂酰乙醇胺標準液作為內(nèi)標物加入到供試樣品中，重復上述步驟A，通過回收 試驗得到該測量方法的回收率，根據(jù)下列公式II計算出樣品中總磷脂含量； 公式I :樣品中總磷脂的測定含量=Iml反應液中的無機磷含量X26. 31 ; 公式II :樣品中總磷脂含量=樣品中總磷脂的測定含量/回收率。
[0008] 通過步驟A的測定操作，將供試樣品溶液經(jīng)過加熱消解，使樣品中的所有有機磷 完全轉(zhuǎn)變?yōu)闊o機磷后，得消解液；取適量消解液并加入適量的純化水及無機磷顯色液，待轉(zhuǎn) 化的無機磷與無機磷顯色液反應完，以便是無機磷在紫外分光光度計中顯色完全，再通過 紫外分光光度計測定供試樣品溶液以及作為空白的相應溶劑的吸光度，紫外分光光度計的 波長為560-690nm，從而測定出樣品中總磷脂全部轉(zhuǎn)變成無機磷后的吸光度。步驟B中的優(yōu) 級純高氯酸為市售的優(yōu)級純高氯酸，其質(zhì)量濃度為70°/ρ72%。
[0009] 通過步驟Β，以磷酸二氫鉀標準液稀釋成不同的濃度的外標標準液，通過測定的各 外標標準液的吸光度繪制出外標標準曲線，將步驟B中測得的供試樣品溶液的吸光度與外 標標準曲線對照，計算出步驟B中Iml反應液中的無機磷的含量，根據(jù)公式I計算出樣品中 總磷脂的測定含量。
[0010] 為了避免測量方法所產(chǎn)生的誤差，以磷脂酰乙醇胺標準液作為內(nèi)標物加入到所述 供試樣品溶液中，通過回收試驗得到該測量方法的回收率，并通過公式II，最終得到樣品中 總磷脂含量。
[0011] 上述測定方法采用外標法測定血紅蛋白類載氧藥物總磷脂的含量，通過一次檢測 得到血紅蛋白類載氧藥物總磷脂的含量，而避免HPLC方法檢測血紅蛋白類載氧藥物總磷 脂的含量時必須通過多次實驗，分別檢測單一磷脂含量，最后加和成總磷脂含量，因此提高 了檢測通量，縮短了樣品檢測時間，降低了檢測成本，具有良好的經(jīng)濟效應。
[0012] 而且外標法比HPLC法的測量結(jié)果更加準確，靈敏度更高，因此本發(fā)明的測定方法 可以簡單、快速、靈敏地測定血紅蛋白類載氧藥物中總磷脂含量。
[0013] 進一步，所述紫外分光光度計的波長為560_690nm。
[0014] 通過對磷酸二氫鉀標準溶液全波長掃描，測得無機磷在560-690nm波長處均由吸 收，因此，紫外分光光度計的波長為560-690nm，以便于測定反應液中無機磷的吸光度。
[0015] 進一步，所述紫外紫外分光光度計的波長為634nm。
[0016] 無機磷的最大吸收峰位于634nm波長處，因此，紫外分光光度計的波長優(yōu)選為 560-690nm〇
[0017] 進一步，步驟A中的所述供試樣品中的有機溶液的揮發(fā)溫度為60~105°C，并在通 風櫥內(nèi)進行。
[0018] 為了使供試樣品中的有機溶液能夠盡快揮發(fā)，有機溶液的揮發(fā)溫度為60~105°C， 并在通風櫥內(nèi)進行，而且通過通風櫥可以防止有機溶液揮發(fā)對環(huán)境污染，提高試驗的安全 性。
[0019] 進一步