一種鄰苯二甲酸丁酯的表面等離子體共振快速檢測方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于輕紡消費品有毒有害殘留量檢測領域，涉及采用表面等離子體共振(SPR)技術，尤其涉及一種通過檢測樣品萃取液中鄰苯二甲酸丁酯(DBP)抗體的余量來檢測萃取液中DBP含量的一種表面等離子體共振快速檢測方法。
【背景技術】
[0002]鄰苯二甲酸丁酯(DBP)是一種運用廣泛的鄰苯二甲酸酯類增塑劑。在紡織服裝和玩具等輕紡消費品中，鄰苯二甲酸酯類增塑劑主要用于在聚氯乙烯(PVC)、人造革、涂層、油墨印花和熱壓貼花產(chǎn)品中，可以有效降低染料粘度，提高涂層彈性。鄰苯二甲酸酯在紡織印染助劑中也可用作復配組分，因為它是含酯和苯環(huán)結構的非離子化合物，所以親聚酯纖維，從而通過緩染而達到分散染料染色時的勻染作用，是勻染劑的組分之一，也可作為染色載體，具有增塑作用。
[0003]出口消費品(紡織服裝和玩具)的不斷召回和中國臺灣食品行業(yè)爆發(fā)的“起云劑”事件，再次將鄰苯二甲酸酯帶入大眾視野，引起社會的巨大關注?？茖W研究表明鄰苯二甲酸酯類(PAEs)是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，具有雌激素效應，它進入人體后與相應的激素受體結合，干擾體內(nèi)激素正常水平，從而影響生殖、發(fā)育。對男性兒童的影響尤為嚴重。為了降低PAEs對人體的危害風險，歐盟、美國、加拿大、巴西等國家和地區(qū)均已出臺有關法律法規(guī)，對其使用做出了明確的限量要求。目前，國內(nèi)外對于鄰苯二甲酸酯包括DBP的檢測方法的研究，主要利用氣相色譜、氣質聯(lián)用儀、液相色譜、液相色譜-質譜串聯(lián)等作為分析手段。因此，建立靈敏、快捷的DBP的SPR檢測方法，對于探索SPR技術在消費品殘留量檢測中的新應用有重要的實踐意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種靈敏度高、檢測時間短、工作效率高的鄰苯二甲酸丁酯的表面等離子體共振快速檢測方法。
[0005]為了解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案是提供一種鄰苯二甲酸丁酯的表面等離子體共振快速檢測方法，其特征在于:在金芯片的金膜表面修飾上鄰苯二甲酸丁酯DBP單克隆抗體，將修飾后的金芯片置于表面等離子體共振SPR檢測儀中，使目標物DBP和高分子競爭物DBP的牛血清白蛋白DBP-BSA的混合液以流動相流過金膜，則目標物DBP與高分子競爭物DBP-BSA競爭結合到金膜表面的抗體上；通過SPR檢測儀檢測金芯片表面光長的變化；當高分子競爭物DBP-BSA濃度一定時，目標物DBP濃度越低，SPR檢測儀檢測到的信號越高；目標物DBP濃度越高，SPR檢測儀檢測到的信號越低；因此，目標物DBP濃度與SPR檢測儀檢測到的信號呈反比關系，從而間接測定金芯片表面DBP含量。
[0006]優(yōu)選地，具體步驟如下:
[0007]步驟1:傳感金芯片的修飾
[0008]1.1清洗:將氨水、過氧化氫及去離子水配成溶液，水浴加熱至溶液冒氣泡，將金芯片放置在此溶液中浸泡，然后取出后立即用去離子水沖洗，再用氮氣吹干金芯片表面；
[0009]1.2自組裝雙功能分子:清洗好的金芯片用11-巰基十一烷酸乙醇溶液浸沒，浸泡過夜；通過Au-S鍵共價連接自組裝雙功能分子；將浸泡過夜的金芯片用滅菌水清洗，用N2吹干；
[0010]1.3雙功能分子活化:在金芯片表面先滴加EDC溶液，再滴加NHS溶液，室溫靜置；
[0011]1.4修飾單抗:將金芯片水洗吹干，在金芯片表面滴加DBP單克隆抗體溶液，置于十旦溫箱中；
[0012]1.5封閉活性位點:將金芯片取出并水洗吹干，在金芯片表面滴加乙醇胺鹽酸鹽溶液，室溫靜置；將金芯片洗凈吹干備用，或放置于PBS溶液中貯存；
[0013]步驟2:DBP標準樣品測定
[0014]2.1基線平衡:將修飾過的金芯片放入表面等離子體共振SPR檢測儀，調(diào)節(jié)儀器溫度，通入PBS溶液，調(diào)節(jié)流速，待SPR檢測儀檢測出的信號穩(wěn)定后開始實驗；實驗在固定角條件下進行；
[0015]2.2競爭物濃度的確定:通過定量環(huán)加載競爭物標準溶液，待達到吸附/解吸附平衡后，通入PBS溶液清洗金芯片，洗去非特異性吸附樣品，通過特異性吸附樣品的量進行目標物分析；以共振響應單位A RU值為縱坐標，以加入的競爭物標準溶液濃度為橫坐標繪制曲線，曲線達到平衡的濃度即為合適的競爭物濃度；
[0016]其中，競爭物標準溶液為:稱取一定量的DBP-BSA，加入PBS溶液定容，配置系列DBP-BSA標準溶液的濃度為:5?70ppm ；
[0017]2.3標準曲線的建立:通過定量環(huán)加載樣品標準溶液，待達到吸附/解吸附平衡后，通入PBS溶液清洗金芯片；以共振響應單位ARU值為縱坐標，以加入的樣品標準溶液中DBP的濃度為橫坐標繪制曲線；
[0018]其中樣品標準溶液為:步驟2.2中所述合適的競爭物濃度的DBP-BSA與x ppm的DBP 混合溶液(X = 5n，n e [0,9])；
[0019]2.4樣品測試:按照標準曲線法測試樣品標準溶液，根據(jù)其ARU值，在標準曲線上讀出DBP含量；
[0020]2.5芯片再生:檢測完樣品標準溶液，通入甘氨酸-鹽酸再生液進行金芯片再生；最后，通入PBS溶液清洗金芯片。
[0021 ] 優(yōu)選地，所述步驟1.2中，11-巰基十一烷酸乙醇溶液濃度為lmmol/L，溫度為4°C。
[0022]優(yōu)選地，所述步驟1.3中，EDC溶液和NHS溶液均為150 μ L ;室溫靜置時間為lh。
[0023]優(yōu)選地，所述步驟1.4中，DBP單克隆抗體溶液為200 μ L ;置于37 °C恒溫箱中3h。
[0024]優(yōu)選地，所述步驟1.5中，乙醇胺鹽酸鹽溶液為200 μ L、lmol/L,室溫靜置時間為lh ;PBS 溶液為 4°C ο
[0025]優(yōu)選地，所述步驟2.1中，調(diào)節(jié)儀器溫度使其低于室溫1?2°C，調(diào)節(jié)PBS溶液流速為 30 μL/min。
[0026]優(yōu)選地，所述步驟2.5中，通入pH = 2.2的甘氨酸-鹽酸再生液6min進行芯片再生。
[0027]優(yōu)選地，所述DBP-BSA為DBP偶聯(lián)蛋白；
[0028]所述EDC溶液為0.4mol/L的1_(3_ 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亞胺鹽溶液；
[0029]所述NHS溶液為0.lmol/L的N_羥基琥珀酰亞胺溶液；
[0030]所述PBS溶液為pH = 7.4的磷酸鹽緩沖液。
[0031]相比現(xiàn)有技術，本發(fā)明具有如下有益效果:
[0032]1、采用間接SPR檢測方法測定DBP的含量，通過修飾DBP單抗，檢測樣品溶液中剩余DBP-BSA高分子競爭物的含量來間接測定DBP的濃度，有效提高了靈敏度；檢測時間短，一般15min內(nèi)即可檢測出結果，樣品用量少；
[0033]2、通過SPR儀記錄，減少了人為判斷的主觀性，芯片可實現(xiàn)批量修飾，工作效率尚ο
【具體實施方式】
[0034]為使本發(fā)明更明顯易懂，茲以一優(yōu)選實施例，作詳細說明如下。
[0035]本發(fā)明提供了一種鄰苯二甲酸丁酯的表面等離子體共振快速檢測方法，利用帶有表面等離子體共振傳感器的SPR檢測儀，以檢測固定角光強的變化，間接測定樣品中DBP的含量。主要技術方案是:在金膜表面修飾上DBP單克隆抗體(DBP-6C6)，流過金膜的流動相是目標物DBP和高分子競爭物DBP的牛血清白蛋白(DBP-BSA)的混合液。目標物DBP與加入的高分子競爭物DBP-BSA競爭結合到芯片表面的抗體上，當高分子競爭物DBP-BSA濃度一定時，目標物DBP濃度越低，信號越高；DBP濃度越高，信號越低。因此，目標物DBP濃度與信號呈一定的反比關系。通過SPR檢測儀檢測溶液中未被結合的DBP-BSA，從而間接測定待測樣品中DBP含量。具體操作步驟如下:
[0036]步驟1:傳感芯片的修飾
[0037]1.1清洗:1份30%的氨水(ΝΗ40Η)和1份30%的過氧化氫(H202)，加入5份的去離子水，水浴加熱至溶液輕微冒氣泡，此時溫度約80?90°C。將金芯片放置在此溶液中浸泡10分鐘，取出后立即用去離子水沖洗，再用氮氣吹干芯片表面，并盡快開始實驗。當使用全新金芯片，可簡化為:用去離子水對芯片表面進行清洗，后再用氮氣吹干即可。
[0038]1.2自組裝雙功能分子:清洗好的金片用lmmol/L的11-巰基^^一烷酸(MUA)乙醇溶液浸沒，4°C浸泡過夜。通過Au-S鍵共價連接自組裝雙功能分子。將浸泡過夜的芯片用滅菌水清洗，用N2吹干。
[0039]1.3雙功能分子活化:在芯片表面先滴加1