一種全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的方法及試劑卡的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種全血快速測(cè)定同型半胱氨 酸的方法及試劑卡。
【背景技術(shù)】
[0002] 同型半胱氨酸（HCY)是蛋氨酸代謝生產(chǎn)的一種含硫氨基酸，80%的HCY在血中通 過(guò)二硫鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合，只有很少一部分游離同型半胱氨酸參加循環(huán)。同型半胱氨酸作為 獨(dú)立的心血管風(fēng)險(xiǎn)指標(biāo)已被廣泛接受，是高血脂、吸煙、糖尿病之外的又一危險(xiǎn)因子。盡管 許多有關(guān)尚同型半脫氣酸血癥的生物化學(xué)基礎(chǔ)有待明確，其檢測(cè)與各種疾病的關(guān)系和治療 檢測(cè)將需進(jìn)一步探討。
[0003] 目前測(cè)定人體內(nèi)同型半胱氨酸的方法主要有：化學(xué)發(fā)光法，胱硫醚法，水解酶法， 液體熒光法等，以上所有的方法均需要對(duì)全血進(jìn)行預(yù)先分離紅細(xì)胞再進(jìn)行測(cè)試，需要專門 的分離裝置，因?yàn)槿械募t細(xì)胞含有大量的同型半胱氨酸，對(duì)測(cè)試結(jié)果有很大的影響，溶 血或紅細(xì)胞去除不干凈，均會(huì)影響測(cè)定結(jié)果。而且上述所有的方法均為液相反應(yīng)體系，需要 專門的設(shè)備進(jìn)行反應(yīng)。因此上述所有的方法都不能實(shí)現(xiàn)高效、簡(jiǎn)便地進(jìn)行同型半胱氨酸的 測(cè)試，更不方便在戶外及偏遠(yuǎn)地區(qū)進(jìn)行即時(shí)檢測(cè)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種能夠簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，在任何地方進(jìn)行即 時(shí)檢測(cè)的全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的方法及試劑卡。
[0005] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種全血快速測(cè)定同型半胱 氨酸的方法，包括以下步驟：
[0006] (1)通過(guò)過(guò)濾材料對(duì)全血進(jìn)行過(guò)濾處理，以過(guò)濾掉全血中的紅細(xì)胞；
[0007] (2)通過(guò)抗紅細(xì)胞抗體對(duì)過(guò)濾處理后的全血進(jìn)行吸附處理，以吸附掉未被過(guò)濾掉 的紅細(xì)胞；
[0008] (3)通過(guò)還原劑將吸附處理后的全血中的同型半胱氨酸還原成還原態(tài)同型半胱氨 酸，然后通過(guò)同型半胱氨酸裂解酶對(duì)還原態(tài)同型半胱氨酸進(jìn)行裂解，產(chǎn)生H 2S ;
[0009] (4)令H2S與顯色劑進(jìn)行熒光反應(yīng)，最后判讀結(jié)果。
[0010] 優(yōu)選的，所述過(guò)濾材料為纖維素膜，所述還原劑為2-巰基乙醇，所述顯色劑包括 三氯化鐵和Ν，Ν' -二正丁基對(duì)苯二胺。
[0011] 本發(fā)明全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的方法的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0012] 1.本發(fā)明不需要使用專門的分離裝置，通過(guò)過(guò)濾材料和抗紅細(xì)胞抗體能夠去除全 血中的紅細(xì)胞，而且去除效果非常好，從而能夠保證測(cè)試準(zhǔn)確度，并極大地簡(jiǎn)化了操作。
[0013] 2.本發(fā)明通過(guò)還原劑將吸附處理后的全血中的同型半胱氨酸還原成還原態(tài)同型 半胱氨酸，然后通過(guò)同型半胱氨酸裂解酶對(duì)還原態(tài)同型半胱氨酸進(jìn)行裂解，產(chǎn)生H 2S，最后 通過(guò)H2S顯色的經(jīng)典方法與三氯化鐵和Ν，Ν' -二正丁基對(duì)苯二胺發(fā)生熒光反應(yīng)，所得產(chǎn)物 在660nm的激光照射下發(fā)出710nm的焚光，最后通過(guò)焚光測(cè)定儀判讀結(jié)果即可，非常地快捷 方便；另外，除能通過(guò)熒光判讀外，該產(chǎn)物在可見(jiàn)光下也可以識(shí)別，因此可以進(jìn)行人工判讀， 適用于在沒(méi)有儀器設(shè)備的環(huán)境條件下使用，十分方便。
[0014] 3.本發(fā)明直接采全血進(jìn)行測(cè)定，不容易發(fā)生溶血現(xiàn)象，因此測(cè)量結(jié)果更加準(zhǔn)確。
[0015] 本發(fā)明提供一種全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的試劑卡，從上到下依次包括過(guò)濾 層、試劑層和顯色層，所述過(guò)濾層采用過(guò)濾材料制成，所述過(guò)濾層中含有抗紅細(xì)胞抗體，所 述試劑層中含有還原劑和同型半胱氨酸裂解酶，所述顯色層中含有顯色劑。
[0016] 本發(fā)明提供另一種全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的試劑卡，從上到下依次包括過(guò)濾 層、吸附層、試劑層和顯色層，所述過(guò)濾層采用過(guò)濾材料制成，所述吸附層中含有抗紅細(xì)胞 抗體，所述試劑層中含有還原劑和同型半胱氨酸裂解酶，所述顯色層中含有顯色劑。
[0017] 作為第一種和第二種全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的試劑卡的優(yōu)選，所述過(guò)濾材料 為纖維素膜，所述還原劑為2-巰基乙醇，所述顯色劑包括三氯化鐵和Ν，Ν' -二正丁基對(duì)苯 二胺。
[0018] 作為第一種和第二種全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的試劑卡的優(yōu)選，所述試劑層采 用硝酸纖維素膜制成，所述顯色層采用定性濾紙制成。
[0019] 作為第二種全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的試劑卡的優(yōu)選，所述吸附層采用纖維素 膜制成。
[0020] 作為第一種和第二種全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的試劑卡的優(yōu)選，2-巰基乙醇的 用量為〇. 1-lg/dm2,同型半胱氨酸裂解酶的用量為1-10KU/dm2,三氯化鐵的用量為40- 60mmol/dm 2, N, Ν' -二正丁基對(duì)苯二胺的用量為 24-36mmol/dm2。
[0021] 作為第一種全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的試劑卡的優(yōu)選，所述抗紅細(xì)胞抗體通過(guò) 以下方法包含在所述過(guò)濾層中：用磷酸鹽緩沖液將抗紅細(xì)胞抗體稀釋至0. 1-0. 5mg/ml， 然后放入過(guò)濾層，搖床浸泡1一2小時(shí)，再將過(guò)濾層取出，吸干水分，干燥處理后即可。
[0022] 作為第二種全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的試劑卡的優(yōu)選，所述抗紅細(xì)胞抗體通過(guò) 以下方法包含在所述吸附層中：用磷酸鹽緩沖液將抗紅細(xì)胞抗體稀釋至0. 1-0. 5mg/ml， 然后放入吸附層，搖床浸泡1一2小時(shí)，再將吸附層取出，吸干水分，干燥處理后即可。
[0023] 本發(fā)明全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的試劑卡的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0024] 1.本發(fā)明不需要使用專門的分離裝置，通過(guò)過(guò)濾材料和抗紅細(xì)胞抗體能夠去除全 血中的紅細(xì)胞，而且去除效果非常好，從而能夠保證測(cè)試準(zhǔn)確度，并極大地簡(jiǎn)化了操作。
[0025] 2.本發(fā)明通過(guò)還原劑將吸附處理后的全血中的同型半胱氨酸還原成還原態(tài)同型 半胱氨酸，然后通過(guò)同型半胱氨酸裂解酶對(duì)還原態(tài)同型半胱氨酸進(jìn)行裂解，產(chǎn)生H2S，最后 通過(guò)H 2S顯色的經(jīng)典方法與三氯化鐵和Ν，Ν' -二正丁基對(duì)苯二胺發(fā)生熒光反應(yīng)，所得產(chǎn)物 在660nm的激光照射下發(fā)出710nm的焚光，最后通過(guò)焚光測(cè)定儀判讀結(jié)果即可，非常地快捷 方便；另外，除能通過(guò)熒光判讀外，該產(chǎn)物在可見(jiàn)光下也可以識(shí)別，因此可以進(jìn)行人工判讀， 適用于在沒(méi)有儀器設(shè)備的環(huán)境條件下使用。
[0026] 3.本發(fā)明不需要專門的設(shè)備進(jìn)行反應(yīng)，所有的反應(yīng)過(guò)程，包括還原反應(yīng)、裂解反應(yīng) 和熒光反應(yīng)均在試劑卡上完成，極大地簡(jiǎn)化了操作；另外同型半胱氨酸的還原和還原態(tài)同 型半胱氨酸的裂解幾乎是同時(shí)發(fā)生，極大地加快了測(cè)試進(jìn)程。
[0027] 4.本發(fā)明直接采全血進(jìn)行測(cè)定，不容易發(fā)生溶血現(xiàn)象，因此測(cè)量結(jié)果更加準(zhǔn)確。
[0028] 綜上，本發(fā)明能夠簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確測(cè)定人血清中同型半胱氨酸的含量，實(shí)現(xiàn)了在 任何地方即時(shí)檢測(cè)的目的。
【附圖說(shuō)明】
[0029] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1、2、3的全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的試劑卡的結(jié)構(gòu)示意 圖。
[0030] 圖2是本發(fā)明實(shí)施例4的全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的試劑卡的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0031] 圖3是本發(fā)明實(shí)施例1的全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的試劑卡的相關(guān)性曲線圖。
[0032] 圖4是本發(fā)明實(shí)施例1的全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的試劑卡的產(chǎn)品線性曲線 圖。
[0033] 附圖中各部件的標(biāo)記為：1過(guò)濾層、2吸附層、3試劑層、4顯色層。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合附圖、實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步描述：
[0035] 本部分對(duì)本發(fā)明實(shí)驗(yàn)中所使用到的材料以及試驗(yàn)方法進(jìn)行一般性的描述。雖然為 實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的許多材料和操作方法是本領(lǐng)域公知的，但是本發(fā)明在此作盡可能 詳細(xì)描述。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，在下文中，如果未特別說(shuō)明，本發(fā)明所用材料、設(shè)備和操 作方法是本領(lǐng)域公知的。例如，纖維素膜為市售的Whatman LFl型號(hào)，同型半胱氨酸購(gòu)自 SIGMA0
[0036] 實(shí)施例1
[0037] 參見(jiàn)圖1，本實(shí)施例的全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的試劑卡，從上到下依次包括過(guò) 濾層1、吸附層2、試劑層3和顯色層4,所述過(guò)濾層1和吸附層2采用纖維素膜制成，所述吸 附層2中含有抗紅細(xì)胞抗體，所述試劑層3采用硝酸纖維素膜（NC)制成，所述試劑層3中 含有還原劑2-巰基乙醇和同型半胱氨酸裂解酶，所述顯色層4采用定性濾紙制成，所述顯 色層4中含有顯色劑三氯化鐵和Ν，Ν' -二正丁基對(duì)苯二胺；
[0038] 過(guò)濾層1、吸附層2、試劑層3和顯色層4的厚度分別為200 μηι、370 μηι、250 μπκ 120 μπι，2-巰基乙醇的用量為0. 5g/dm2,同型半胱氨酸裂解酶的用量為5KU/dm2,三氯化鐵 的用量為50mmol/dm 2, N, Ν' -二正丁基對(duì)苯二胺的用量為30mmol/dm2;
[0039] 具體制作時(shí)，所述抗紅細(xì)胞抗體通過(guò)以下方法包含在所述吸附層2中：用pH7. 4的 磷酸鹽緩沖液將抗紅細(xì)胞抗體稀釋至〇. 3mg/ml，然后放入吸附層2,搖床浸泡1. 5小時(shí)，再 將吸附層2取出，用吸水紙吸干水分，在37°C的條件下干燥處理7h即可；將2-巰基乙醇和 同型半胱氨酸裂解酶混合后噴涂到試劑層3上，晾干即可；將三氯化鐵和Ν，Ν' -二正丁基對(duì) 苯二胺混合后噴涂到顯色層4上，晾干即可；最后將過(guò)濾層1、吸附層2、試劑層3和顯色層 4復(fù)合在一起。
[0040] 實(shí)施例2
[0041] 參見(jiàn)圖1，本實(shí)施例的全血快速測(cè)定同型半胱氨酸的試劑卡，從上到下依次包括過(guò) 濾層1、吸附層2、試劑層3和顯色層4,所述過(guò)濾層1和吸附層2采用纖維素膜制成，所述吸 附層2中含有抗紅細(xì)胞抗體，所述試劑層3采用硝酸纖維素膜（NC)制成，所述試劑層3中 含有還原劑2-巰基乙醇和同型半胱氨酸裂解酶，所述顯色層4采用定性濾紙制成，所述顯 色層4中含有顯色劑三氯化鐵和Ν，Ν' -二正丁基對(duì)苯二胺；
[0042] 過(guò)濾層1、吸附層2、試劑層3和顯色層4的厚度分別為120 μηι、250 μηι、120 μπι、 370 μπι，2-巰基乙醇的用量為0. lg/dm2,同型半胱氨酸裂解酶的用量為lKU/dm2,三氯化鐵 的用量為40mmol/dm 2, N, Ν' -二正丁基對(duì)苯二胺的用量為24mmol/dm2;
[0043] 具體制作時(shí)，所述抗紅細(xì)胞抗體通過(guò)以下方法包含在所述吸附層2中：用pH7. 4的 磷酸鹽緩沖液將抗紅細(xì)胞抗體稀釋至〇. lmg/ml，然后放入吸附層2,搖床浸泡2小時(shí)，再將