多糖結(jié)合疫苗中殘余cdap的高效液相色譜檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于測(cè)試分析領(lǐng)域，具體為一種利用高效液相色譜測(cè)定CDAP的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 多糖結(jié)合疫苗是通過(guò)化學(xué)方法將多糖抗原與載體蛋白共價(jià)結(jié)合，抗原類(lèi)型從 胸腺非依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵僖蕾囆钥乖?，能激發(fā)2歲以下兒童、老年人和免疫缺陷者 體內(nèi)產(chǎn)生有效的免疫應(yīng)答，并產(chǎn)生免疫記憶，誘導(dǎo)產(chǎn)生的保護(hù)性抗體主要為免疫球蛋白 (Immunoglobulin，Ig)G，比多糖疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgM更有效，且能維持較長(zhǎng)時(shí)間，具有多糖 疫苗不可比擬的優(yōu)勢(shì)。
[0003] 在多糖結(jié)合疫苗的制備工藝中，通常采用活化劑如溴化氰對(duì)細(xì)菌多糖進(jìn)行活化。 與溴化氰一樣，1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟化硼（CDAP)能夠活化多糖形成氰酸酯 (-0-C = N)。但相比于溴化氰，CDAP具有較強(qiáng)的活化效率且安全性高，被廣泛的應(yīng)用在多糖 結(jié)合疫苗的制造領(lǐng)域。雖然該物質(zhì)毒性低，但為了對(duì)結(jié)合疫苗中殘余CDAP進(jìn)行有效監(jiān)控， 準(zhǔn)確測(cè)定多糖結(jié)合原液疫苗中CDAP的殘留量對(duì)疫苗產(chǎn)品質(zhì)量控制具有重要意義。
[0004]目前，國(guó)外采用薄層色譜法（TLC)，僅能用來(lái)測(cè)定CDAP的純度，國(guó)內(nèi)尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道 多糖結(jié)合疫苗中CDAP殘留量的測(cè)定方法，因此如何對(duì)多糖結(jié)合疫苗中CDAP殘留量的測(cè)定 仍是一個(gè)技術(shù)難點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種多糖結(jié)合疫苗中殘余CDAP高效液相色譜的檢測(cè)方法。 通過(guò)該方法，可準(zhǔn)確、快速實(shí)現(xiàn)多糖結(jié)合疫苗中殘余CDAP的有效監(jiān)控。
[0006] 本發(fā)明所述的多糖結(jié)合疫苗中殘余CDAP高效液相色譜測(cè)定方法，包括如下步驟：
[0007] (1)用CDAP標(biāo)準(zhǔn)品配制對(duì)照品洛液；
[0008] (2)待檢樣品用超濾離心管進(jìn)行離心，收取濾過(guò)液用0.45 μ m膜過(guò)濾作為供試品 溶液；
[0009] (3)供試品溶液和對(duì)照品溶液CDAP分別上樣于高效液相色譜柱，上樣后進(jìn)行洗 脫，記錄色譜圖；
[0010] (4)根據(jù)對(duì)照品溶液CDAP濃度及其色譜峰面積，供試品溶液CDAP色譜峰面積，根 據(jù)外標(biāo)法計(jì)算試樣中CDAP的濃度。
[0011] CDAP濃度計(jì)算公式如下所示：
[0012] C2= (A2^-A1) XC1 (1)
[0013] 式中：
[0014] C2-試樣中 CDAP 含量，ng/ml ;
[0015] A2-供試品中CDAP色譜峰面積；
[0016] A「對(duì)照品中CDAP色譜峰面積；
[0017] C「對(duì)照品中 CDAP 含量，ng/ml。
[0018] CDAP含量計(jì)算公式如下所示：
[0019] F = (C2+ C0) (2)
[0020] 式中：
[0021] F 試樣中 CDAP 含量，ng/mg ;
[0022] C2-試樣中 CDAP 含量，ng/ml ;
[0023] C。-試樣中多糖含量，mg/ml ;
[0024] 本發(fā)明的有益效果如下：
[0025] 本發(fā)明提供的多糖結(jié)合疫苗中殘余CDAP的高效液相色譜檢測(cè)方法，在試樣處理 中，用3K D的超濾管5000g離心20分鐘排除了細(xì)菌多糖對(duì)CDAP測(cè)定的干擾，試樣中CDAP 能得到良好分離和準(zhǔn)確定量。兩組加標(biāo)樣品中CDAP的回收率分別為94. 9%和95. 8%。本 發(fā)明方法簡(jiǎn)單、操作方便、精確度高，為試樣中CDAP的測(cè)定提供了良好的條件，可以用于流 腦、HIB及肺炎等多種多糖結(jié)合疫苗中CDAP殘余的測(cè)定。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為專(zhuān)屬性測(cè)定結(jié)果
【具體實(shí)施方式】
[0027] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述，但不應(yīng)用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。
[0028] 實(shí)施例1
[0029] A群流腦多糖衍生物中CDAP殘余的測(cè)定：
[0030] 1.精密制取2000ng/ml CDAP標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣品1 ;
[0031 ] 2. A群流腦多糖衍生物用3KD的超濾管5000g離心20分鐘，收取濾過(guò)液用0· 45 μ m 膜過(guò)濾作為供試品溶液；測(cè)定A群流腦多糖衍生物樣品的糖濃度，為4. 67mg/ml (C。），取待 檢的A群流腦多糖衍生物作為樣品2 ;
[0032] 3.樣品1，樣品2分別按照色譜條件進(jìn)行上樣檢測(cè)；
[0033] 色譜條件的設(shè)定：
[0034] 3. 1流動(dòng)相：乙臆-水-二氣乙酸（60 : 40 : 0· 1);
[0035] 3.2色譜柱：(：18，了51^61005-100￥(4.6臟\250臟，5以111)，購(gòu)自東曹生物科技有限 公司；
[0036] 3. 3檢測(cè)器：PDA檢測(cè)器；
[0037] 3. 4檢測(cè)方法：色譜峰面積外標(biāo)定量法；
[0038] 3.5進(jìn)樣體積：15以1，
[0039] 3. 6色譜柱溫度：30°C ;
[0040] 3. 7 流速：lml/min。
[0041] 4.樣品1，樣品2的峰面積分別為：196778, 259714 ;
[0042] 根據(jù)公式（1)計(jì)算試樣中CDAP的濃度：
[0043] C2= (A2^A1) XC1= (259714+196788) X2000 = 2639. 5ng/ml。
[0044] 根據(jù)公式（2)計(jì)算A群多糖衍生物中CDAP的含量：
[0045] F = C2 + C0= 2639. 5 + 4. 67 = 565. 20ng/mg。
[0046] 實(shí)施例2
[0047] A群流腦多糖結(jié)合物原液中CDAP殘余的測(cè)定：
[0048] 1.精密制取2000ng/ml CDAP標(biāo)準(zhǔn)溶液作為樣品1 ;
[0049] 2. A群流腦多糖結(jié)合物原液用3KD的超濾管5000g離心20分鐘，收取濾過(guò)液用 0. 45 μ m膜過(guò)濾作為供試品溶液；測(cè)定A群流腦多糖結(jié)合物原液樣品的糖濃度，為0. 24mg/ ml (C。)，取待檢的A群流腦多糖結(jié)合物原液作為樣品2 ;
[0050] 3.樣品1，樣品2分別按照色譜條件進(jìn)行上樣檢測(cè)；
[0051] 色譜條件的設(shè)定：
[0052] 3. 1流動(dòng)相：乙臆-水-二氣乙酸（60 : 40 : 0· 1);
[0053] 3.2色譜柱：(：18，了51^61005-100￥(4.6臟\250臟，5以111)，購(gòu)自東曹生物科技有限 公司；
[0054] 3. 3檢測(cè)器：PDA檢測(cè)器；
[0055] 3. 4檢測(cè)方法：色譜峰面積外標(biāo)定量法；
[0056] 3. 5 進(jìn)樣體積：15 μ 1，
[0057] 3. 6色譜柱溫度：30 °C ;
[0058] 3. 7 流速：lml/min。
[0059] 4.樣品1，樣品2的峰面積分別為：204992,368 ;
[0060] 根據(jù)公式⑴計(jì)算試樣中CDAP的濃度：
[0061] C2= (A2^A1) XC1= (368 + 204992) X2000 = 3. 59ng/ml。
[0062] 根據(jù)公式（2)計(jì)算A群多糖衍生物中CDAP的含量：
[0063] F = C2 + C0= 3. 59 + 0. 24 = 14. 96ng/mg。
[0064] 本發(fā)明方法的方法學(xué)驗(yàn)證：
[0065] 專(zhuān)屬性驗(yàn)證：
[0066] 由于在制備結(jié)合物過(guò)程中主要涉及以下化學(xué)物質(zhì)，因此在進(jìn)行方法專(zhuān)屬性研究時(shí) 分別用10 μ g/ml濃度的CDAP標(biāo)準(zhǔn)品、水空白、乙腈、lmg/ml氯化鈉、lmg/ml碳酸氫鈉、Img/ ml ADH以及0. 1%的三乙胺按照實(shí)施例1中的方法進(jìn)行檢測(cè)，測(cè)試結(jié)果見(jiàn)附圖1 :
[0067] 10 μ g/ml濃度的CDAP在2. 526min明顯單峰（見(jiàn)圖1)，而氯化鈉、碳酸氫鈉 、ADH 以及0. 1 %的三乙胺成分在此位置未出現(xiàn)任何吸收峰，因此說(shuō)明該方法對(duì)CDAP進(jìn)行檢測(cè)專(zhuān) 屬性良好。檢測(cè)限、定量限驗(yàn)證：
[0068] 分別配制20-140ng/ml低濃度的CDAP標(biāo)準(zhǔn)樣品，按照實(shí)施例1中方法進(jìn)行進(jìn)樣檢 測(cè)，結(jié)果如表1所示：
[0069] 表1不同濃度CDAP信噪比（S/N)測(cè)定結(jié)果
[0071] 當(dāng)CDAP濃度為35ng/ml時(shí)S/N = 8,滿足信噪比至少為3 : 1，初步確定為CDAP 的檢測(cè)限；當(dāng)CDAP濃度為40ng/ml時(shí)，信噪比約為10 : 1，確定40ng/ml的濃度為CDAP檢 測(cè)的定量限。線性驗(yàn)證：
[0072] 分別配制 160ng/ml、320ng/ml、640ng/ml、1 μ g/ml、2 μ g/ml 及 4 μ g/ml 6 個(gè)濃度 的CDAP對(duì)照品溶液，按照實(shí)施例1中方法進(jìn)行進(jìn)樣檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示：各個(gè)樣品在 2. 5分左右均出現(xiàn)洗脫峰，線性回歸方程為y = 109769X-2203. 1，R2= 0. 9999(n = 6)，線 性成立。
[0073] 表2標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定值
[0075] 精密度驗(yàn)證：
[0076] 取A群多糖衍生物試樣，按照實(shí)施例1的方法平行測(cè)定測(cè)定5次CDAP的含量，計(jì) 算精密度。測(cè)試結(jié)果如下表3所示：
[0077] 表3精密度測(cè)定表
[0079] 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0. 17%，說(shuō)明精密度良好。
[0080] 回收率測(cè)定：
[0081 ] 在A群多糖衍生物樣品中分別添加320ng/ml和640ng/ml的CDAP標(biāo)準(zhǔn)品各三份， 按照實(shí)施例1的方法測(cè)定試樣中CDAP的含量。測(cè)定量與加入量相比為CDAP的回收率。測(cè) 定結(jié)果如下表4所示：
[0082] 表4A群多糖衍生物中CDAP回收率
[0083]
[0084] 兩組加標(biāo)樣品回收率分別為95. 8%和94. 9%，測(cè)定結(jié)果顯示了該方法用于測(cè)定 多糖衍生物中CDAP殘留量具有良好的準(zhǔn)確度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 多糖結(jié)合疫苗中殘余CDAP高效液相色譜測(cè)定方法，其特征在于包括如下步驟： (1) 用CDAP標(biāo)準(zhǔn)品配制對(duì)照品洛液； (2) 待檢樣品用超濾離心管進(jìn)行離心，收取濾過(guò)液用0. 45μm膜過(guò)濾作為供試品溶液； (3) 供試品溶液和對(duì)照品溶液CDAP分別上樣于高效液相色譜柱，上樣后進(jìn)行洗脫，記 錄色譜圖； (4) 根據(jù)對(duì)照品溶液CDAP濃度及其色譜峰面積，供試品溶液CDAP色譜峰面積，采用外 標(biāo)法計(jì)算試樣中CDAP的濃度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于：步驟⑵中所述的待檢樣品為多糖 衍生物、多糖結(jié)合物原液及多糖結(jié)合疫苗。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于：步驟（2)中所述的超濾離心管為 3Kd-10Kd〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于：步驟（3)中所述的高效液相色譜柱 為ODS-Cls柱。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于：步驟（3)中所述的洗脫的流動(dòng)相為 乙腈-水溶液。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于：步驟（3)中所述的上樣體積為 10_20 y-1〇7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的測(cè)定方法，其特征在于：步驟⑶中所述的記錄色譜圖是在 檢測(cè)波長(zhǎng)為280-300nm下記錄。
【專(zhuān)利摘要】1-氰基-4-二甲氨基-吡啶四氟化硼(CDAP)能夠活化多糖形成氰酸酯，而被用于多糖結(jié)合疫苗的制備工藝中；本發(fā)明提供一種多糖結(jié)合疫苗中殘余CDAP的高效液相色譜檢測(cè)方法，包括步驟：用CDAP標(biāo)準(zhǔn)品配制對(duì)照品溶液；將待檢樣品用超濾離心管進(jìn)行離心，收取濾過(guò)液用0.45μm膜過(guò)濾作為供試品溶液；供試品溶液和對(duì)照品溶液CDAP分別上樣于高效液相色譜柱，上樣后進(jìn)行洗脫，記錄色譜圖；根據(jù)對(duì)照品溶液CDAP濃度及其色譜峰面積，供試品溶液CDAP色譜峰面積，采用外標(biāo)法計(jì)算試樣中CDAP的濃度。本發(fā)明方法簡(jiǎn)單、操作方便、精確度高，可準(zhǔn)確、快速實(shí)現(xiàn)多糖結(jié)合疫苗中殘余CDAP的有效監(jiān)控。
【IPC分類(lèi)】G01N30/02
【公開(kāi)號(hào)】CN105301141
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510851509
【發(fā)明人】張曉華, 孫述學(xué), 王震, 褚自青, 周荔葆, 王振業(yè), 劉曉磊, 李曉帆
【申請(qǐng)人】北京成大天和生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年11月30日