一種使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測(cè)抗核小體抗體IgG的試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測(cè)抗 核小體抗體IgG的試劑盒及其制備方法和檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗核小體抗體（anti-nucleosome antibody，AnuA)主要是由B細(xì)胞產(chǎn)生的抗核 小體分子的自身抗體。核小體是染色體的功能亞單位，是DNA與組蛋白形成的復(fù)合體，存 在于細(xì)胞核中。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)發(fā)生中，核小體是主要的自身抗原，抗核小體抗 體是SLE的早期的指標(biāo)之一。許多文獻(xiàn)認(rèn)為抗核小體抗體是診斷SLE很好的標(biāo)志，它優(yōu)于 抗dsDNA，敏感度高，且有很高的特異度。研究表明，核小體是SLE的主要自身抗原，可能與 SLE發(fā)病及病理變化直接相關(guān)。SLE患者細(xì)胞凋亡異常導(dǎo)致的核小體過度釋放，可能是本病 免疫異常的主要誘發(fā)環(huán)節(jié)之一。核小體及其特異性自身抗體除了在致病機(jī)制方面成為近年 來SLE研究的最活躍的領(lǐng)域，抗核小體抗體在臨床中對(duì)SLE診斷和治療的作用也得到重視。 臨床研究提示，抗核小體抗體與SLE疾病活動(dòng)性及狼瘡性腎炎的發(fā)生明顯相關(guān)，可能是SLE 的特異性抗體之一。靶器官中免疫復(fù)合物的沉積和炎性介質(zhì)（包括補(bǔ)體）的大量活化是引 起SLE全身性組織炎癥損傷的基本機(jī)制之一。核小體會(huì)成為多克隆B細(xì)胞活化劑，這可能 與SLE疾病的起始階段有關(guān)；但更重要的是，核小體是SLE中致病性T輔助細(xì)胞識(shí)別的自身 抗原，不僅引起同源B細(xì)胞產(chǎn)生核小體特異性自身抗體，而且引起抗DNA抗體和抗組蛋白抗 體的形成。文獻(xiàn)報(bào)道，AnuA在抗ds-DNA陰性的SLE患者中有很高的陽性率（可達(dá)60%~ 65% )，因此AnuA對(duì)SLE患者更具有診斷價(jià)值。
[0003] 中國專利CN103105489A公開了檢測(cè)自身免疫性疾病抗體的免疫印跡試劑盒及其 制備方法，涉及一種檢測(cè)多種自身免疫性疾病相關(guān)抗體的免疫印跡試劑盒，解決目前尚無 用于多種自身免疫性疾病體檢篩查的免疫印跡產(chǎn)品技術(shù)上的不足：在所述的硝酸纖維素 膜或尼龍膜上含有：分別由 dsDNA、Sm/RNP、CCP、SSA，SSB，GAD、ICA、IA-2A、TG，AMA-M2 共 10 種中的至少兩種天然或重組抗原包被而成的兩條以上平行的檢測(cè)線，1條高濃度質(zhì)控帶，1 條中濃度質(zhì)控帶及1條低濃度質(zhì)控帶。該專利公開的是一種膜條免疫法，更能說明膜條免 疫法存在的靈敏度較低、線性范圍窄、重復(fù)性差和反應(yīng)時(shí)間長的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供一種使用磁微粒化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)抗核 小體抗體IgG的試劑盒，其能夠以較低的成本制備得到，且能夠?qū)崿F(xiàn)抗核小體抗體IgG準(zhǔn)確 和高精確地定量測(cè)定。
[0005] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種使用磁微粒化學(xué)發(fā)光定量檢測(cè)抗核小 體抗體IgG的試劑盒，所述試劑盒包括：抗核小體抗體IgG校準(zhǔn)品、抗核小體抗體IgG試劑 1號(hào)、抗核小體抗體IgG試劑2號(hào)、抗核小體抗體IgG磁分離試劑、抗核小體抗體IgG質(zhì)控品 和清洗液。
[0006] 進(jìn)一步的，所述抗核小體抗體IgG校準(zhǔn)品包括6個(gè)液體校準(zhǔn)瓶，所述液體校準(zhǔn)瓶內(nèi) 目標(biāo)濃度分別為0、5、20、50、100、200RU/mL的抗核小體抗體IgG和牛血清白蛋白的Tris緩 沖液；
[0007] 所述抗核小體抗體IgG試劑1號(hào)為1個(gè)含有5mL生物素標(biāo)記的核小體抗原和牛血 清白蛋白的Tris緩沖液的瓶；
[0008] 所述抗核小體抗體IgG試劑2號(hào)為1個(gè)含有15mL堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人多克 隆抗體和牛血清白蛋白的Tris緩沖液的瓶；
[0009] 所述抗核小體抗體IgG磁分離試劑為1個(gè)含有5mL鏈霉親和素標(biāo)記的磁微粒和牛 血清白蛋白的Tris緩沖液瓶；所述抗核小體抗體IgG質(zhì)控品包括2個(gè)質(zhì)控瓶，所述質(zhì)控瓶 內(nèi)的濃度的范圍分別為：16-24RU/mL和80-120RU/mL。
[0010] 所述試劑盒檢測(cè)原理為將待測(cè)樣品、所述抗核小體抗體IgG試劑1號(hào)混合溫育，樣 品中的抗核小體抗體IgG與核小體抗原特異性結(jié)合，再加入包被鏈霉親和素的磁微粒，抗 核小體抗體IgG與核小體抗原的免疫復(fù)合物被吸附到磁微粒表面，洗滌去除未結(jié)合的抗體 和雜質(zhì)，加入抗核小體抗體IgG試劑2號(hào)并混合溫育。堿性磷酸酶標(biāo)記（ALP)的羊抗人IgG 抗體與已經(jīng)結(jié)合在磁珠上的抗核小體抗體IgG特異性結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì) 后加入化學(xué)發(fā)光底物，ALP催化底物發(fā)光，測(cè)定相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度（RLU)。在一定范圍內(nèi)RLU與 樣品中抗核小體抗體IgG濃度呈正比，通過RLU就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測(cè)樣品的抗 核小體抗體IgG含量。
[0011] 本發(fā)明采取的又一技術(shù)方案是：一種抗核小體抗體IgG的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢 測(cè)試劑盒的制備方法，所述試劑盒的制備方法包括以下步驟：
[0012] 步驟1.制備所述抗核小體抗體IgG校準(zhǔn)品包括：抗核小體抗體IgG校準(zhǔn)品稀釋液 配制步驟和抗核小體抗體IgG校準(zhǔn)品配制步驟：
[0013] 所述抗核小體抗體IgG校準(zhǔn)品稀釋液的配制步驟包括：
[0014] 加800mL純化水和11. 2g的Tris到容器中，攪拌混合均勻，再加8. 5g的氯化鈉和 2mL的Proclin300,攪拌至完全溶解，將pH值調(diào)為7. 0-7. 5,加40g的牛血清白蛋白到容器 中，攪拌至完全溶解，再將pH值調(diào)為7. 0-7. 5,用純化水定容至1L，使用0.2 μπι濾器過濾， 將獲得的所述校準(zhǔn)品稀釋液保存在2-8°C待用；
[0015] 所述抗核小體抗體IgG校準(zhǔn)品的配制步驟包括：
[0016] 用上述抗核小體抗體IgG校準(zhǔn)品稀釋液將抗核小體抗體IgG分別配制為0、5、20、 50、100、200RU/mL 共 6 個(gè)濃度點(diǎn)；
[0017] 步驟2.制備所述抗核小體抗體IgG試劑1號(hào)包括：抗核小體抗體IgG試劑1號(hào)稀 釋液配制步驟和抗核小體抗體IgG試劑1號(hào)配制步驟：
[0018] 所述抗核小體抗體IgG試劑1號(hào)稀釋液的配制步驟：
[0019] 加800mL純化水、12. Ig的Tris和5. 8g的NaCl于IL容器中，攪拌至完全溶解， 再加入2mL的Proclin300,攪拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白，攪拌至完全溶解， 將pH值調(diào)為7. 0-7. 5,用純化水定容至1L，使用0. 2 μ m濾器過濾，將獲得的所述試劑1號(hào) 稀釋液保存在2-8 °C待用；
[0020] 所述抗核小體抗體IgG試劑1號(hào)的配制步驟：
[0021] 用0· 2mol/L的ρΗ9· 0碳酸鹽緩沖液配制0· 5mg/mL的生物素溶液，按照核小體抗 原與生物素溶液質(zhì)量比為10:1的比例在核小體抗原溶液中加入到上述0. 5mg/mL的生物素 溶液，混合均勻，室溫靜置18h，反應(yīng)生成核小體抗原-生物素連接物的反應(yīng)液，將得到的核 小體抗原-生物素連接物反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去未反應(yīng)的生物素，得到核 小體抗原-生物素連接物，再用所述試劑1號(hào)稀釋液將核小體抗原-生物素連接物稀釋到 0. 1-0. 3 μ g/mL，得到所述的試劑1號(hào)；
[0022] 步驟3.制備所述抗核小體抗體IgG試劑2號(hào)包括：抗核小體抗體IgG試劑2號(hào)稀 釋液配制步驟和抗核小體抗體IgG試劑2號(hào)的配制步驟：
[0023] 所述抗核小體抗體IgG試劑2號(hào)稀釋液的配制步驟：
[0024] 加800mL純化水、6. 06g的4-羥乙基哌嗪乙磺和8. 5g的NaCl到容器中，攪拌至完 全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白、0.1 g的ZnCl2、0. 2mL的Proclin 300和0.1 g的MgCl2， 攪拌至完全溶解，將pH值調(diào)為7. 5-8. 0,用純化水定容至1L，使用0. 2um濾器過濾，將獲得 的所述試劑2號(hào)稀釋液保存在2-8 °C待用；
[0025] 所述抗核小體抗體IgG試劑2號(hào)的配制步驟：
[0026] 將Img的羊抗人抗體和2-4 μ L的IOmg/mL的偶聯(lián)劑為2-亞胺四氫噻吩溶液， 室溫靜置20min，加入0. lmol/L的甘氨酸溶液10 yL，室溫靜置5min，用G-25凝膠柱除 鹽，收集活化后抗體，將活化后的抗體保存在2-8°C備用，取I. 5mg的堿性磷酸酶溶液，加 入5mg/mL的4-(N-馬來酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液10-20 μ L，室 溫靜置30min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后堿性磷酸酶，將活化后的堿性磷酸酶保存 在2-8°C備用，再將上述活化的羊抗人抗體與活化的堿性磷酸酶混合，在2-8°C條件下靜置 12-24h，用Supperdex200凝膠純化柱純化，獲得羊抗人抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液，置 于2-8 °C保存?zhèn)溆茫瑢⒀蚩谷丝贵w-堿性磷酸酶連接物濃溶液用所述試劑2號(hào)稀釋液稀釋到 0. 02-0. 1 μ g/mL，得到所述的試劑2號(hào)；
[0027] 步驟4.制備所述抗核小體抗體IgG磁分離試劑包括：抗核小體抗體IgG磁分離試 劑稀釋液配制步驟和抗核小體抗體IgG磁分離試劑配制步驟：
[0028] 所述抗核小體抗體IgG磁分離試劑稀釋液配制步驟：
[0029] 加800mL純化水、12. Ig的Tris和8. 5g的NaCl到容器中，攪拌至完全溶解，再加 5g的牛血清白蛋白、50mL的新生牛血清和0. 2mL的Proclin300,攪拌至完全溶解，將pH值 調(diào)為7. 9-8. 1，用純化水定容至1L，使用0. 2um濾器過濾，將獲得的所述磁分離試劑稀釋液 保存在2-8 °C待用；
[0030] 所述抗核小體抗體IgG磁分離試劑配制步驟：
[0031] 取IOOmg磁微粒，磁分離去上清，取用0· 025mol/L的pH值為4. 5-6的2-嗎啉乙磺