金剛烷胺藥物殘留快速檢測試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測金剛烷胺藥物殘留快速檢測試紙條，屬于食品安全快速檢測領域。
技術背景
[0002]金剛烷胺是最早用于抑制流感病毒的抗病毒藥，美國于亞洲感冒流行的1966年批準其作為預防藥。并于1976年在預防藥的基礎上確認其為治療藥。該藥對成年患者的療效及安全性已得到廣泛認同。但治療劑量與產生副作用的劑量很接近，對高齡者及有慢性心肺疾病或腎臟疾病者的劑量和給藥計劃很難確定，因此尚未在臨床上推廣應用。在日本，金剛烷胺一直作為帕金森病的治療藥，直到1998年才被批準用于流感病毒A型感染性疾病的治療。
[0003]金剛烷胺可用于亞洲甲-1I型流感的預防和早期治療，與抗菌素合用可治敗血癥和病毒性肺炎，并有退燒作用。也有抗震顫麻痹的作用。適用于原發(fā)性帕金森病、腦炎后的帕金森綜合征、藥物誘發(fā)的錐體外系反應、一氧化碳中毒后帕金森綜合征及老年人合并有腦動脈硬化的帕金森綜合征。
[0004]根據其藥理作用，國內現在主要將金剛烷胺用于雞、豬流感的預防和早期治療，及豬傳染性胃腸炎的防治。為避免影響國家動物疫病強制性免疫政策落實，給重大動物疫病防控工作帶來不良后果，農業(yè)部發(fā)布《關于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，規(guī)定除經批準生產、使用的疫苗產品外，禁止使用金剛烷胺防治高致病性禽流感等一類病原微生物引起的病毒性疫病。
[0005]2005年農業(yè)部《關于清查金剛烷胺等抗病毒藥物的緊急通知》，已將金剛烷胺、金剛乙胺等列入《獸藥地方標準廢止目錄》，明確要求立即停止生產、經營和使用，違者按生產、經營假獸藥和使用禁用獸藥處理。
[0006]2005年中國政府《農業(yè)部公告(第560號)》也明確指出，“金剛烷胺類等人用抗病毒藥移植獸用，缺乏科學規(guī)范、安全有效實驗數據，用于動物病毒性疫病不但給動物疫病控制帶來不良后果，而且影響國家動物疫病防控政策的實施?！?br> 2012年11月底被爆出養(yǎng)殖的一只雞從孵出到端上餐桌，只需要45天，是用飼料和藥物喂養(yǎng)的。其中一些不法商販采用金剛烷胺人用藥物，用于抑制禽類的禽流感等病癥。其原因是價格低廉，但如果用量不當會導致其在禽類體內殘留或禽流感病毒變異，人體食用后會對人體造成傷害。
[0007]我國對于動物源性食品中金剛烷胺殘留含量的相關研究報道屬于空白，也未曾制定或立項過國家標準、行業(yè)標準，國際上也無特定限量要求及相應檢測方法。研究食品中金剛烷胺殘留含量的檢測技術，對于指導進出口食品中金剛烷胺含量控制，有效應對日本肯定列表制度，及時消除潛在的出口貿易障礙，促進相關行業(yè)拓展國際市場，具有緊迫的現實意義。

【發(fā)明內容】

[0008]本發(fā)明的目的:研制出特異、敏感、快速、簡便的金剛烷胺藥物殘留快速檢測試紙條。
[0009]本發(fā)明的技術方案:
一種金剛烷胺藥物殘留快速檢測試紙條，底層為支撐層，中間層吸附層固定在支撐層上，外層保護膜固定在吸附層上，吸附層從測試端依次為纖維層，吸附金標抗體纖維層，纖維素膜層及手柄端的吸水材料層，其中在纖維素膜層上有用偶聯金剛烷胺藥物的載體蛋白溶液印制的直線式檢測印跡，用羊抗或兔抗小鼠IgG溶液印制的直線式對照印跡，檢測印跡和對照印跡平行組合排列為“II”。支撐層是用不吸水的硬質塑膠片條或硬紙條制成。測試端纖維層用玻璃棉、或尼龍膜、或聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、或聚酚膜制成，優(yōu)選玻璃棉。吸水材料層用吸水紙制成。纖維素膜層用硝酸纖維素膜、或純纖維素膜，或梭化纖維素膜制成。金標抗體纖維層用吸附金剛烷胺藥物的金標抗體玻璃棉，金剛烷胺藥物金標抗體為膠體金標記金剛烷胺藥物的單克隆抗體或多克隆抗體，偶聯金剛烷胺藥物的載體蛋白溶液為金剛烷胺藥物與載體蛋白偶聯的復合溶液。在測試端吸附纖維層、金標抗體纖維層及吸水材料層上覆蓋有保護膜，在測試端纖維層與金標抗體纖維層交界處對應的保護膜上印制有樣品標記線，該標記線偏向測試端纖維層一側約0.5cm處。偶聯金剛烷胺藥物的載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA ),或為雞卵清白蛋白(0VA),或為鐵蛋白，或為血藍蛋白。
[0010]本發(fā)明的金剛烷胺藥物殘留快速檢測試紙條具有以下優(yōu)點:
(1)特異性強，敏感性高。該試紙條以膠體金標記高親和力的單克隆抗體為基礎制備而成，金標抗體中金顆粒與抗體分子之間無共價鍵形成，二者通過異性電荷間的范德華力相結合，膠體金標對單克隆抗體特異性和親和力影響很小，且具有較高的標記率。因此，快速檢測試紙條具有較高的特異性和敏感性。
[0011](2)操作簡便、快速。使用本發(fā)明試紙條時無需任何其它試劑，只需滴加100 μ 1左右待檢樣品于樣品墊上，在5分鐘內即可判定檢測結果。
[0012](3)結果顯示形象、直觀、準確。本測試紙條以顯示紅棕色“I”及“II”印跡作為檢測的陽性和陰性標記，即在纖維素膜上顯示一條棕紅色“1”印跡表示在被檢測樣品液中含有金剛烷胺，兩條棕紅色“ II ”印跡表示在被檢樣品中不含金剛烷胺，結果判定形象、直觀、準確，簡單明了，不易出現假陰性和假陽性誤判。
[0013](4)成本低，投資少。使用快速檢測試紙條，不需另配儀器設備及其它試劑，隨時隨地進行檢測，費用低廉，可節(jié)省大量貴重儀器及設備費用。
[0014](5)應用范圍廣，便于推廣應用。本發(fā)明快速檢測試紙操作簡單，能滿足不同層次人員的需要，包括專業(yè)化驗、海關檢疫、衛(wèi)生防疫、質量監(jiān)測、畜產品加工、集約化養(yǎng)殖到個體養(yǎng)殖等，具有廣闊的市場前景和較好的經濟、社會效益。
【附圖說明】
[0015]圖1為金剛烷胺藥物殘留快速檢測試紙條結構示意圖(其中1、樣品吸收墊；2、結合物釋放墊；3、反應膜；4、吸水墊；5、檢測線；6.質控線；7、底板)。
[0016]圖2為金剛烷胺藥物殘留快速檢測試紙條俯視結構示意圖(其中8-1和8-2是覆蓋在試紙卡兩端的保護膜，9為標記線)。
[0017]圖3為金剛烷胺藥物快速檢測試紙卡陰性(圖3.a )、陽性(圖3.b)，無效(圖3.c)顯色示意圖，其中T質控區(qū)，C為檢測區(qū)。
【具體實施方式】
[0018]制備金剛烷胺藥物殘留快速檢測試紙條，首先需制備偶聯金剛烷胺藥物的載體蛋白和金標抗體，從而制備檢測印跡和金標抗體纖維；其次需制備羊抗或兔抗小鼠IgG抗體，用于制備對照印跡。
[0019]1.金剛烷胺藥物與載體蛋白的偶聯
分別采用混合酸酐法和碳化二亞胺法將金剛烷胺藥物和卵清蛋白和血藍蛋白偶聯得到包被原(用于固定在反應膜上)和免疫原(用于制備單克隆抗體)。
[0020](1)包被原的制備:
①將5mg金剛烷胺藥物0.5mL甲酰胺(DMF )溶解，冷卻至10°C，加入氯甲酸異丁酯5 μ 1，4°C攪拌反應30min，即可得到反應液I液；
②稱取卵清蛋白(OVA)30mg,使之充分溶解在2mL 50mM碳酸鈉溶液中，即可得到反應液II液；其中金剛烷胺藥物半抗原與所述卵清蛋白的摩爾配比為(15-20 ):1。
[0021]③將反應I液逐滴緩慢滴加到該反應II溶液中，4°C反應4 h，4 °C過夜。取最終反應物于PH7.4，0.02M磷酸鹽緩沖液中透析純化24 h，3000 g以上離心30 min,收集上清液，即得到包被原。
[0022](2)免疫原的制備:
①將5mg金剛烷胺藥物、10mgN-羥基琥珀酰亞胺(NHS )，以及12.5 mg碳化二亞胺(EDC)充分溶解于1 mL DMF中，于室溫下攪拌24 h，即可得到反應液I液；
②稱取血藍蛋白40mg，使之充分溶解在3 mL 40 mM碳酸鈉溶液中，即得到反應液II液，其中金剛烷胺藥物半抗原與所述血藍蛋白的摩爾配比為(12-15):1。
[0023]③將反應液I液逐滴緩慢滴加到反應液II液中，并于室溫下攪拌3 h，然后4 °〇過夜，過柱，用緩沖液平衡和洗脫，進一步純化后得到免疫原。
[0024]2.抗金剛烷胺藥物單克隆抗體的制備
(1)動物免疫:將免疫原注入到Balb/c小鼠體內，免疫劑量為100 μ g/只，使其產生抗血清。
[0025](2)細胞融合和克隆化:小鼠血清測定結果較高后，取其脾細胞，按7:1比例(數量配比)與SP2/0骨髓瘤細胞融合，采用間接競爭ELISA測定細胞上清液，篩選陽性孔。