一種用于人腦疾病檢測的試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明具體涉及一種通過檢測人腦紅蛋白檢測人腦疾病及診斷的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 腦紅蛋白（Neuroglobin, NGB)是體內(nèi)除了血紅蛋白和肌紅蛋白之外的第三類重 要的攜氧蛋白，在神經(jīng)系統(tǒng)中特異表達，廣泛分布于腦組織內(nèi)。和肌紅蛋白一樣，腦紅蛋白 能可逆地結(jié)合氧，且與氧有很高的親和力。肌紅蛋白在正常人血清內(nèi)含量極微，當(dāng)心肌和骨 骼肌損傷時，肌紅蛋白可從受損細胞釋放，快速入血，導(dǎo)致血清肌紅蛋白升高。肌紅蛋白已 成為臨床上一些重要疾病如心肌梗塞、腎功能衰竭等敏感而又特異的生化診斷指標。腦紅 蛋白和肌紅蛋白在功能和性質(zhì)上具有嚴格的相似性：腦紅蛋白有151個氨基酸，分子量為 17千道爾頓，而肌紅蛋白則有154個氨基酸，分子量也為17千道爾頓。鑒于腦紅蛋白與肌 紅蛋白在功能上具有嚴格的相似性，即肌紅蛋白負責(zé)心肌和骨骼肌的氧供應(yīng)，腦紅蛋白則 負責(zé)腦的氧供應(yīng)，兩者均能從損傷細胞中釋放入血，因此，腦紅蛋白在老年性癡呆、腦梗塞、 創(chuàng)傷性腦損傷等涉及到神經(jīng)元損傷和變性死亡等疾病的早期診斷中具有潛在的診斷價值， 同時對上述疾病治療過程中的病程跟蹤也具有重要的參考價值。因此，檢測血液中腦紅蛋 白的含量具有重要的意義。
[0003] 系統(tǒng)進化指數(shù)富集技術(shù)（SELEX技術(shù)）是20世紀90年代初發(fā)展起來的一種新的 組合化學(xué)技術(shù)，其運用大容量的隨機寡核苷酸文庫，結(jié)合體外PCR擴增技術(shù)，以指數(shù)富集 與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過多輪篩選，獲得親和力高、特異性強的寡核苷酸適配子 (aptamers)。該技術(shù)己成功運用于許多祀分子的篩選，包括金屬離子、有機染料、藥物、蛋白 質(zhì)、氨基酸以及各種細胞因子等。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是通過系統(tǒng)進化指數(shù)富集技術(shù)（SELEX技術(shù))篩選腦紅蛋白的寡核苷 酸適配子來替代抗體，提供一種簡潔快速、高靈敏度、高特異性的腦紅蛋白早期檢測及分離 純化方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案： 本發(fā)明中用于系統(tǒng)進化指數(shù)富集技術(shù)篩選的單鏈DNA隨機文庫及引物，由美 國invitrogen公司合成，兩端為固定序列，中間為41個堿基的隨機序列：5'-TGGACCATTACGATCAACTA(N41)TAACCCGATACGATTATCCA-3'，庫容量為 1014 以上； 引物 1: 5' - TGGACCATTACGATCAACTA- 3' ； 引物 2: 5' - TGGATAATCGTATCGGGTTA -3'。
[0006] 人腦紅蛋白根據(jù)（吳永紅等，"重組人源腦紅蛋白的高效表達、純化及鑒定"，中 國生物工程雜志，2009, 29 ( 9) : 1~6 )的方法制備獲得； GelRed核酸染料購于Biotium公司； 硝酸纖維素濾膜購于美國密理博(MilliPore)公司； 寡聚核苷酸的純化試劑購于北京天為時代公司； PCR試劑盒和T載體購于美國普洛麥格（ftOmega)公司。
[0007] -種親和人腦紅蛋白核酸適配子，其特征在于核苷酸序列為：SEQ ID NO :1-17任 一所示的DNA分子。
[0008] -種上述親和人腦紅蛋白核酸適配子，其特征在于：具有相同功能的寡核苷酸適 配子同源序列占60%以上。
[0009] -種上述親和人腦紅蛋白核酸適配子，其特征在于：衍生的RNA序列具有相同的 功能。
[0010] -種上述親和人腦紅蛋白核酸適配子，其特征在于：為能與DNA序列進行雜交的 寡核苷酸序列。
[0011] -種上述親和人腦紅蛋白核酸適配子，其特征在于：在核酸適配子的任何位置刪 除或增加部分寡核苷酸殘基所得到的寡核苷酸適配子序列具有相同的功能。
[0012] -種上述親和人腦紅蛋白核酸適配子，其特征在于：在核酸適配子的任何位置進 行核苷酸種類和稀有堿基的置換后，得到的寡核苷酸適配子序列具有相同的功能。
[0013] -種上述親和人腦紅蛋白核酸適配子，其特征在于：在核酸適配子的任何位置進 行磷酸化、甲基化、氨基、巰基、同位素、生物素、地高辛、熒光物質(zhì)、納米發(fā)光材料或酶標記 修飾后，得到的寡核苷酸適配子序列具有相同的功能。
[0014] 一種上述親和人腦紅蛋白核酸適配子，其特征在于：用于人腦紅蛋白的檢測和分 離純化，從而用于腦疾病的檢測。
[0015] -種上述親和人腦紅蛋白核酸適配子的制備方法，按以下步驟進行：1)單鏈DNA 隨機寡核苷酸文庫的合成；2)利用系統(tǒng)進化指數(shù)富集方法對寡核苷酸文庫進行篩選；3)擴 增與人白蛋白特異結(jié)合的寡核苷酸；4)進行下一輪篩選，經(jīng)過12輪以上篩選后獲得目的寡 核苷酸序列；5)克隆測序。
[0016] 本發(fā)明的優(yōu)點是：具有簡便、快速、經(jīng)濟等特點，與其他組合化學(xué)庫如隨機肽庫、 抗體庫和噬菌體表面展示文庫相比，從寡核苷酸文庫中篩選出的適配子具許多優(yōu)勢：1)本 身是寡核苷酸，分子量較小，可以化學(xué)合成，節(jié)約成本；2)具有比抗體更高的親和性和特異 性；3)便于標記且可以在不同部位有選擇性的標記；4)重復(fù)性和穩(wěn)定性好，且易于保存，即 對高溫和劇烈條件不敏感。因此，系統(tǒng)進化指數(shù)富集技術(shù)具有良好的應(yīng)用前景。
【具體實施方式】
[0017] 實施例1人腦紅蛋白的制備 根據(jù)（吳永紅等，"重組人源腦紅蛋白的高效表達、純化及鑒定"，中國生物工程雜志， 2009,29 ( 9) : 1~6)的方法制備獲得人腦紅蛋白，蛋白濃度為100mg/mL。
[0018] 實施例2合成隨機單鏈DNA文庫和引物 隨機單鏈 DNA(ssDNA)文庫：5' - TGGACCATTACGATCAACTA (N41) TAACCCGATA CGATTA TCCA-3'，構(gòu)建了長度為81nt的隨機ssDNA文庫，兩端為固定引物序列，中間為41個堿基 的隨機序列，庫容量為1014以上；引物1:5' -TGGACCATTACGATCAACTA- 3' ；引物2:5'-TGGATAATCGTATCGGGTTA -3' ；將隨機ssDNA文庫和兩種引物均用TE緩沖液配制成100 μ mol/L貯存液_20° C貯存?zhèn)溆谩?br>[0019] 將單鏈DNA文庫擴增為雙鏈DNA，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以 回收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機文庫，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。75 μ g RNA文庫經(jīng)硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與2ug人腦紅蛋白蛋白， 37° C孵育30min，反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖 液（6mol/L 尿素，0. 55mol/L 醋酸銨，1.5mmol/LEDTA，0. 15%SDS)中煮沸 5min，離心，取 上清，無水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于20 μ I DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴增雙鏈 DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA文庫用于下一輪篩選；每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以 該雙鏈DNA為模板體外轉(zhuǎn)錄出RNA適配子庫，篩選共進行10輪。得到了 17個適配子，其序 列分別為SEQ ID NO: 1-17所示。具體序列如下所示： NGB-I:TGGACCATTACGATCAACTATTCTCAACAACTCCAACTTGTCCCTACCAAATTCGTACTTTTAACCC GATACGATTATCCA; NGB-2:TGGACCATTACGATCAACTAACAATATTCAAATTCTCTAAAACATCTTCCAATTCTCAATATAACCC GATACGATTATCCA; NGB-3:TGGACCATTACGATCAACTATTACACACAATCCTACCTATTTATCCCTACACATTCCCTCATAACCC GATACGATTATCCA; NGB-4:TGGACCATTACGATCAACTAACACACCAACCACTCCCTCTTCGCTTATTATCTCTACATATTAACCC GATACGATTATCCA; NGB-5:TGGACCATTACGATCAACTAACGCTTTATTATCATAAATATACATAACACCCAACACCTCCTAACCC GATACGATTATCCA; NGB-6:TGGACCATTACGATCAACTAATCGCTCAATACTCTGACCTATAATATAACGCTTACCTCCTTAACCC GATACGATTATCCA; NGB-7:TGGACCATTACGATCAACTACTAATACAATTCGCTCTCCCATACACCGCCTAAATTCATAATAACCC GATACGATTATCCA; NGB-8:TGGACCATTACGATCAACTAACTCGCTATATCCTGATATCCCTAACCGTTATACCTATAACTAACCC GATACGATTATCCA; NGB-9:TGGACCATTACGATCAACTATCATTTAATCAATACACATAGTATATATTCCGCCTACATTCTAACCC GATACGATTATCCA; NGB-IO:TGGACCATTACGATCAACTACATCGCTAATTAACATCCCATCTGCCCAAAATAATCTTATTTAACC CGATACGATTATCCA; NGB-Il:TGGACCATTACGATCAACTATAGACATTGATCATCAGAATAACCCCAACTCCTCCCAATCTTAACC CGATACGATTATCCA; NGB-I2:TGGACCATTACGATCAACTATAACACTAATTAATTAAATATACACACTCCTATACCAATATTAACC CGATACGATTATCCA; NGB-I3:TGGACCATTACGATCAACTAACATCAGCAATCTCTCGCATATCTTTCATCCCTTCATCATTTAACC CGATACGATTATCCA; NGB-14:TGGACCATTACGATCAACTAAATTCTATCCCAACGCTTACGCTTCCAAGAACATCTCCCTATAACC CGATACGATTATCCA; NGB-I5:TGGACCATTACGATCAACTACTATTGAACATATTAGATCCGCACAATCTTTGTACATATACTAACC CGATACGATTATCCA; NGB-16:TGGACCATTACGATCAACTAAAGATTATCCATAATGTTATAGTAACTCTGTAAACACTTTATAACC CGATACGATTATCCA; NGB-I7:TGGACCATTACGATCAACTAATAGATCATCCGCTTTAACCCCGATAACTCTAAACGACTAATAACC CGATACGATTATCCA; 實施例3蛋白結(jié)合適配子的性能測定 將適配子分別取2.0 μ g，用牛小腸堿性磷酸酶（CIP) 37° C消化lh，純化回收去磷 酸化的RNA ;通過T4多核苷酸激酶標記[γ -32P] ATP于去磷酸化的RNA分子末端。IOnmol 放射性標記的適配子分別與不同濃度（1_200ηΜ)的人腦紅蛋白37° C孵育30min，各組反 應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計數(shù)儀測定濾膜上殘留的放射量，同 一樣品平行做兩次測定。計算各個適配子與目的蛋白的解離常數(shù)。結(jié)果如下：
實施例4所述適配子特異性分析以及穩(wěn)定性分析 分別采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，pgl20蛋白，大腸桿菌外膜蛋白A，腦紅蛋白， 與17條適配子進行特異性檢測，經(jīng)過結(jié)合試驗發(fā)現(xiàn)，這些適配子都不與這些蛋白相結(jié)合， 而只與人蛋白結(jié)合保持較高的特異性。
[0020] 將所述的適配子，取0. 2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置二周。通過 RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)二周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有被降解。
[0021] 實施例5所述適配子疾病的診斷 取8個老年性癡呆和腦梗塞患者和4個正常人的血液，使用生理鹽水稀釋，獲得目標樣 本。
[0022] 將17個偶聯(lián)有標記的適配子分別與8個患者以及4個正常人的樣本混合40min， 通過生物素分離，定量分析其中的人腦紅蛋白的含量，通過分析發(fā)現(xiàn)，8個患者中腦紅蛋白 的含量顯著增加，超過了規(guī)定的閾值。達到了相應(yīng)腦病的診斷標準。由此可見，其診斷效果 較好。
[0023] 以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本 發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項】
1. 一種用于人腦疾病檢測的試劑盒，其含有能特異性與人腦紅蛋白結(jié)合的核酸適體。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述核酸適體序列如SEQIDNo:1-17任 一所述。3. -種檢測人腦疾病的方法，其特征在于利用權(quán)利要求1-2所述的試劑盒。4. 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述疾病為老年性癡呆或腦梗塞。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人腦疾病檢測及診斷試劑盒。該試劑盒主要含有用于特異性檢測人腦紅蛋白的適配體；本試劑盒具有較高的靈敏度，可用于檢測樣品中腦紅蛋白的含量，并可為老年性癡呆、腦梗塞、創(chuàng)傷性腦損傷等涉及到神經(jīng)元損傷和變性死亡等疾病中的早期診斷及治療過程中的病程跟蹤提供有效的檢測手段。
【IPC分類】G01N33/68, G01N33/72
【公開號】CN105301262
【申請?zhí)枴緾N201510842663
【發(fā)明人】盧美珍
【申請人】盧美珍
【公開日】2016年2月3日
【申請日】2015年11月29日