檢測(cè)供體特異性抗體的方法和用于實(shí)施所述方法的系統(tǒng)的制作方法
【專利說明】檢測(cè)供體特異性抗體的方法和用于實(shí)施所述方法的系統(tǒng)
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求對(duì)2013年3月14提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)系列第61/782, 003號(hào)（其 公開內(nèi)容通過引用整體并入本文）的提交日期的優(yōu)先權(quán)。
[0003] 背景
[0004] 每年世界上進(jìn)行100,000多例實(shí)體器官移植，包括每年在美國進(jìn)行的數(shù)萬例移 植。盡管在免疫抑制和移植后護(hù)理方面取決了顯著的改善，但長期的移植物功能不太理想。 在美國，死亡和活供體的腎移植物的經(jīng)調(diào)整的10年異體移植物存活率分別僅為約40%和 60%。繼發(fā)于抗體介導(dǎo)的排斥（AMR)的早期和晚期移植失敗是低移植物存活率的重要原 因。
[0005] 針對(duì)人白細(xì)胞抗原（HLA)的抗體是存在于移植候選者或受體的血液中的循環(huán)抗 體，其為較早致敏事件（輸血、先前的移植或妊娠）的結(jié)果。移植前存在的供體特異性抗體 (DSA)可引起超急性排斥和立即移植物失功，并且可通過移植前交叉配血來評(píng)估。在最近幾 年，監(jiān)測(cè)針對(duì)供體特異性HLA-I類和II類錯(cuò)配的臨床相關(guān)抗體的移植后發(fā)生的概念一直是 移植界內(nèi)關(guān)注的重要領(lǐng)域。無論在移植前還是移植后檢測(cè)，當(dāng)未進(jìn)行臨床治療時(shí)，針對(duì)在供 體器官上表達(dá)的抗原的抗體的存在都導(dǎo)致對(duì)移植器官的免疫攻擊，并且增加移植物失功和 /或排斥的風(fēng)險(xiǎn)。DSA攻擊，除其它以外，異體移植物的內(nèi)皮，并且可導(dǎo)致隨后活組織檢查證 明的AMR以及需要增強(qiáng)的免疫抑制的急性損傷。DSA發(fā)展的進(jìn)展和相應(yīng)的臨床事件一起損 害異體移植物，從而隨著時(shí)間的推移導(dǎo)致慢性改變，最終削弱移植物功能和存活。
[0006] 抗體介導(dǎo)的排斥可表現(xiàn)為因記憶應(yīng)答或從頭抗原體產(chǎn)生而導(dǎo)致的早期急性過程， 或表現(xiàn)為因從頭抗體產(chǎn)生而引起的晚期和慢性過程。在急性期中，通常預(yù)先形成導(dǎo)致早期 急性排斥的抗體，但從頭DSA也可在早期移植后期間發(fā)生，從而導(dǎo)致急性排斥。具有預(yù)先形 成的DSA的患者處于顯著更大的患有急性AMR的風(fēng)險(xiǎn)中，并且具有顯著更低的移植物存活 率。
[0007] 慢性排應(yīng)是移植腎失功能（death-censored graft loss)的主要原因之一。同種 抗體介導(dǎo)的損傷和修復(fù)的反復(fù)循環(huán)導(dǎo)致異體移植物的微血管系統(tǒng)的顯著變化。具有預(yù)先形 成的DSA的患者和從頭發(fā)生DSA的患者處于增加的患有慢性排斥的風(fēng)險(xiǎn)中。
[0008] 概述
[0009] 提供了用于測(cè)定供體特異性抗體在生物樣本中的存在或不存在的方法。所述方法 包括通過在足以使受體免疫抗體（如果存在的話）結(jié)合供體細(xì)胞表面抗原（Ag)的條件下 將來自供體的細(xì)胞樣本與來自受體的生物樣本組合來形成混合物以形成免疫抗體-Ag復(fù) 合物，將所述混合物與在其表面上包含特異性結(jié)合免疫抗體-Ag復(fù)合物（例如，Ag或免疫 抗原）的珠?；旌?，在裂解條件下添加特異性結(jié)合結(jié)合于珠粒的免疫抗體-Ag復(fù)合物的可 檢測(cè)地標(biāo)記的抗體，和檢測(cè)結(jié)合于免疫抗體-Ag復(fù)合物的可檢測(cè)地標(biāo)記的抗體的存在或不 存在，以測(cè)定供體特異性抗體在來自受體的生物樣本中的存在或不存在。還提供了用于實(shí) 施主題方法的系統(tǒng)和試劑盒。
[0010] 附圖簡述
[0011] 當(dāng)結(jié)合附圖閱讀時(shí)，可根據(jù)下列詳細(xì)描述最好地理解本發(fā)明。包括在附圖中的是 下列圖：
[0012] 圖1示意性舉例說明用于據(jù)本公開內(nèi)容的一個(gè)實(shí)施方案測(cè)定供體特異性抗體在 生物樣本中的存在或不存在的方法。
[0013] 圖2示意性舉例說明用于根據(jù)本公開內(nèi)容的第二實(shí)施方案測(cè)定供體特異性抗體 在生物樣本中的存在或不存在的方法。
[0014] 圖3顯示包括同時(shí)捕獲和標(biāo)記DSA的DSA-FXM實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。使用區(qū)別在于每一個(gè) 珠粒的內(nèi)部熒光ID的HLA-I類和II類珠粒，通過DSA-FXM測(cè)試4個(gè)樣本。因 HLA特異性 抗體而增強(qiáng)熒光（陽性信號(hào)）示于X軸上。圖3,圖A :HLA-I類（C-I)和II類（C-II)供 體特異性抗體（DSA)呈陰性（CI-/CII-);圖3,圖B :僅C-II DSA呈陽性（CI-/CII+);圖3， 圖 C :僅 C-I DSA 呈陽性（CI+/CII-);和圖 3,圖 D :CI 和 C-II DSA 都呈陽性（CI+/CII+)。
[0015] 圖4顯示包括相繼捕獲和和標(biāo)記DSA的DSA-FXM實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。通過DSA-FXM測(cè)試 陰性AB血清（樣本A)和三個(gè)陽性血清（樣本B、C和D)。樣本A :C-I和C-II DSA呈陰性； 樣本B :C-I和C-II DSA呈陽性；樣本C :僅C-I DSA呈陽性并且C-II DSA呈陰性；樣本D : 僅C-II DSA呈陽性并且C-I DSA呈陰性。
[0016] 圖5提供DSA-FXM實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。通過FXM、DSA-FXM和LMX-IgG針對(duì)不同細(xì)胞數(shù)目 測(cè)試以不同稀釋度存在的HLA-Ab陽性血清（PPS)的混合物。結(jié)果顯示DSA-FXM是用于檢測(cè) DSA的最靈敏的方法并且當(dāng)與標(biāo)準(zhǔn)方法相比較時(shí)使用少得多的細(xì)胞（例如可用少至25, 000 個(gè)細(xì)胞來檢測(cè)DSA)。LMX-IgG在使用單抗原珠粒的Luminex平臺(tái)上確定了 PPS血清中包含 的HLA特異性并且顯示的值是平均熒光強(qiáng)度（MFI)。大于或等于1000MFI的值被認(rèn)為是陽 性的；500-999MFI的值被認(rèn)為可能是陽性的（不明確的）。
[0017] 圖6顯示DSA-FXM實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。通過DSA-FXM，同時(shí)利用盲攻擊和并行地利用定期 流式細(xì)胞交叉配型（FXM)和在單抗原珠粒上進(jìn)行的標(biāo)準(zhǔn)Luminex抗體篩選（LMX-IgG)來測(cè) 試23個(gè)CAP(美國病理學(xué)家學(xué)會(huì)）外部能力樣本。鑒定HLA-I類（C-I)和/SHLA-II(C-II) 的供體特異性抗體（DSA)，并通過LMX-IgG進(jìn)一步確認(rèn)大多數(shù)DSA。一些具有低MCS的額外 DSA只能用更靈敏的DSA-FXM方法檢測(cè)到。外部能力樣本是具有已知的特異性的血清和細(xì) 胞。在從所有參與中心接收所有結(jié)果之前，血清的特異性對(duì)于參與者是未知的。
[0018] 圖7提供DSA-FXM實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。7個(gè)HLA-DQ DSA陽性樣本已被LMX-IgG鑒定，并 且已被DSA-FXM確認(rèn)。歷史上，一直不可能通過任何類型的牽涉細(xì)胞或細(xì)胞提取物的DSA 測(cè)定將所有特異性DSA檢測(cè)成DQ。
[0019] 圖8顯示DSA-FXM實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。6個(gè)HLA-DP DSA陽性樣本已被LMX-IgG鑒定，并 且已被DSA-FXM確認(rèn)。
[0020] 圖9提供DSA-FXM實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。3個(gè)HLA-C DSA陽性樣本已被LMX-IgG鑒定，并且 已被DSA-FXM確認(rèn)。
[0021] 圖10顯示來自DSA-FXM測(cè)試法的實(shí)驗(yàn)性結(jié)果。圖A :HLA-I類（C-I)和II類（C-II) 供體特異性抗體（DSA)呈陰性（CI-/CII-);圖B :僅C-I DSA呈陽性（CI+/CII-);圖C :僅 C-II DSA 呈陽性（CI-/CII+);和圖 D :CI 和 C-II DSA 呈陽性（CI+/CII+)。
[0022] 圖11提供117個(gè)利用已知的I類和II類DSA反應(yīng)性或缺乏其的單獨(dú)的DSA-FXM 測(cè)試的結(jié)果，該結(jié)果顯示與已知的DSA特征譜相關(guān)的反應(yīng)性的互斥模型。
[0023] 圖12顯示針對(duì)I類特異性DSA (B7)的FXM、DSA-FXM和LMX-IgG單抗原珠粒測(cè)定 的靈敏度比較，該比較顯示即使當(dāng)另兩個(gè)測(cè)試是陰性時(shí)，DSA-FXM亦可檢測(cè)靶細(xì)胞上的特異 性 HLA I 類 DSA。
[0024] 圖13顯示針對(duì)II類特異性DSA(DR4)的FXM、DSA-FXM和LMX-IgG單抗原珠粒測(cè) 定的靈敏度比較，該比較顯示即使當(dāng)另兩個(gè)測(cè)試是陰性時(shí)，DSA-FXM亦可檢測(cè)到靶細(xì)胞上的 特異性HLA II類DSA。
[0025] 圖14的圖A和B顯示針對(duì)95個(gè)I類DSA(圖A)和100個(gè)II類DSA(圖B)的FXM 比較的DSA-FXM與LMX-IgG SAB結(jié)果之間的皮爾遜相關(guān)。圖C顯示使用IgG DSA作為標(biāo)準(zhǔn) 的針對(duì)I類和II類的靈敏度和特異度百分比。圖D顯示針對(duì)7個(gè)血清樣本出個(gè)個(gè)體）的 LMX-IgG SAB、LMX-Clq SAB、FXM和DSA-FXM的比較。與LMX-SAB的過度反應(yīng)性相關(guān)的差異。 結(jié)合圖15,結(jié)果顯示LMX-IgG SAB給出假陽性反應(yīng)（即，當(dāng)FXM和DSA-FXM為陰性時(shí)DSA呈 陽性）。這促成了圖15中顯示的較低的特異度。
[0026] 圖15顯示針對(duì)15個(gè)患者的FXM與DSA-FXM的比較，所述患者中有12個(gè)通過FXM 測(cè)定具有未知特異度的針對(duì)抗原的自體抗體（下圖）。這些患者中有4個(gè)（P12-P-15)具有 針對(duì)HLA的自體抗體，如通過DSA-FXM測(cè)定的（上圖）。
[0027] 圖16顯示FXM與DSA-FXM區(qū)分因 DSA種類（I和/或II)而引起的陽性反應(yīng)的能 力的比較。DSA-FXMCI珠粒檢測(cè)所有I類，CIIa檢測(cè)DQ，CIIb檢測(cè)所有DR和DP，但 僅檢測(cè)某些DQ。顯示了 4個(gè)不同類型的結(jié)果。1和3類都具有陽性B細(xì)胞FXM，但案例1歸 因于I類同種抗體，然而案例3歸因于II類同種抗體。案例2和4都具有陽性T和B FXM， 但案例2歸因于自體抗體，然而案例4歸因于I類同種抗體。
[0028] 圖17的圖A顯示針對(duì)在緩沖液中1:2稀釋的和在靜脈注射免疫球蛋白（IVIG)中 1:2稀釋的血清中的I類DSA的DSA-FXM結(jié)果。IVIG用于對(duì)HLA脫敏，降低抗體。常規(guī)FXM 顯示因第二步驟抗-IgG試劑和IVIG與細(xì)胞表面上的未知靶的廣泛反應(yīng)性的存在而導(dǎo)致的 IVIG處理的樣本相較于緩沖液（數(shù)據(jù)未顯示）的增加。DSA-FXM顯示IVIG的抑制，因?yàn)闄z 測(cè)對(duì)于HLA是特異的。因此，DSA-FXM顯示處理的功效。圖B顯示針對(duì)在緩沖液中1:2稀 釋的和在靜脈注射免疫球蛋白（IVIG)中1:2稀釋的血清中的II類DSA的DSA-FXM結(jié)果。 IVIG用于對(duì)HLA脫敏，降低抗體。常規(guī)FXM顯示因第二步驟抗-IgG試劑和IVIG與細(xì)胞表 面上的未知靶的廣泛反應(yīng)性的存在而導(dǎo)致的IVIG處理的樣本相較于緩沖液（數(shù)據(jù)未顯示） 的增加。DSA-FXM顯示IVIG的抑制，因?yàn)闄z測(cè)對(duì)于HLA是特異的。因此，DSA-FXM顯示處理 的功效。
[0029] 圖18的圖A顯示摻有5% IVIG并在不同稀釋度上通過DSA-FXM測(cè)試的陽性DSA 血清的結(jié)果。結(jié)果顯示IVIG對(duì)HLA I類DSA具有劑量依賴性抑制。圖B顯示摻有5% IVIG 并且在不同稀釋度上通過DSA-FXM測(cè)試的陽性DSA血清的結(jié)果。結(jié)果顯示IVIG對(duì)兩種HLA II類DSA具有劑量依賴性抑制。
[0030] 圖19顯示關(guān)于來自經(jīng)歷IVIG脫敏處理以前瞻性地降低/消除鑒定的潛在活供體 的DSA的腎候選者的系列樣本的FXM和DSA-FXM結(jié)果。FXM結(jié)果顯示因 IVIG和Rituxan (治 療性抗-CD20，B細(xì)胞的標(biāo)志物）而引起的增加的MCS值，而DSA-FXM結(jié)果在即使在治療性抗 體存在的情況下亦顯示在對(duì)于移植是可接受的范圍內(nèi)的對(duì)IVIG和MCS值的抑制（功效）。
[0031] 定義
[0032] "供體特異性抗體"或"DSA"意指存在于受體中的特異性結(jié)合供體抗原（例如，供 體細(xì)胞表面抗原）的抗體。DSA可以是"預(yù)先形成的"（例如，在接受來自供體的移植物或 輸血之前存在于受體中）和/或從頭產(chǎn)生的DSA(其由受體響應(yīng)已懷孕或接受來自一個(gè)或 多個(gè)供體的移植物或輸血而產(chǎn)生）。在一些情況下，DSA可以是結(jié)合患者自己細(xì)胞的細(xì)胞表 面組分的自體DSA (自體抗體）。在某些方面，DSA是補(bǔ)體結(jié)合抗體（CFAb)。在某些方面， DSA是針對(duì)HLA抗原的。
[0033] 主題發(fā)明的"親和試劑"具有對(duì)靶分析物具有高結(jié)合親和力的分析物結(jié)合結(jié)構(gòu) 域、部分或組分。高親和力意指至少約10 4M,通常至少約10 6M或更高，例如10 9M或更高的 結(jié)合親和力。親和試劑可以是多種不同種類的分子的任一種，只要其當(dāng)以標(biāo)記的親和配體 形式存在時(shí)展現(xiàn)對(duì)于靶蛋白的必要結(jié)合親和力即可。
[0034] 這樣，親和試劑可以是小分子或大分子配體。小分子配體意指大小范圍在約50至 約10, 000道爾頓，通常地約50至約5, 000道爾頓，更通常地約100至約1000道爾頓內(nèi)的 配體。大分子意指大小在分子量上為約10, 〇〇〇道爾頓或更大的配體。
[0035] 特別吸引人的是大分子親和配體是抗體以及其結(jié)合片段和模擬物。當(dāng)抗體是親和 配體時(shí)