基于上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記和磁分離技術(shù)的氯霉素檢測(cè)新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記和磁分離技術(shù)的氯霉素檢測(cè)新方法。
【背景技術(shù)】
[0002]氯霉素(Chloramphenicol，CAP)是一種酰胺醇類光譜抗生素，曾廣泛用于人體和各種動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療，但被證實(shí)在動(dòng)物性食品中的殘留會(huì)給人類帶來很大的毒副作用，導(dǎo)致視神經(jīng)炎，視力障礙，胃腸道不適，也會(huì)抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血癥和粒狀白細(xì)胞缺乏等疾病，現(xiàn)已禁止了氯霉素的使用。但是由于氯霉素具有良好的抗菌效果且價(jià)格低廉，如今在動(dòng)物性食品中仍有氯霉素的非法添加。目前對(duì)氯霉素的檢測(cè)主要有40微生物學(xué)方法，氣相色譜法，免疫層析法，電化學(xué)法等[3-8]，但這些方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)，部分存在高耗費(fèi)、操作復(fù)雜、耗時(shí)、穩(wěn)定性不足等問題。因此尋找一種更加簡便、穩(wěn)定、靈敏度高的檢測(cè)方法就顯得十分必要。
[0003]上轉(zhuǎn)換熒光納米材料是一種可通過多光子機(jī)制吸收長波輻射發(fā)射出比激發(fā)光波長短的熒光的反stoke移位現(xiàn)象的納米顆粒，即這種材料顆?？赏ㄟ^紅外激發(fā)發(fā)射出可見光。常見的熒光染料，如有機(jī)染料，量子點(diǎn)通過短波長光激發(fā)可能會(huì)破壞生物組織導(dǎo)致自體熒光，降低檢測(cè)的靈敏性。上轉(zhuǎn)換材料由于自身的特殊機(jī)理，有著顯著優(yōu)點(diǎn):光學(xué)穩(wěn)定，斯托克斯移位大，無自體熒光。而磁性納米粒子可利用功能化的表面給體與受體間特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物質(zhì)的快速分離和富集，兩者連用可提高檢測(cè)的靈敏性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明就是針對(duì)上述問題，彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供了一種上轉(zhuǎn)換材料的優(yōu)良性能，將其作為可供檢測(cè)的熒光標(biāo)記物，結(jié)合適配子對(duì)目標(biāo)物的特異性識(shí)別，構(gòu)建了一種簡便、穩(wěn)定、高靈敏的氯霉素檢測(cè)新方法。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的檢測(cè)方法概述如下。
[0006]一種上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記和磁分離技術(shù)的氯霉素檢測(cè)新方法，包括如下步驟:
(1)一步法制備氨基修飾的納米材料Fe304:分別向圓底燒瓶中加入6.5 g 1，6-己二胺，30 mL乙二醇，1.0 g六水合三氯化鐵和2.0 g無水醋酸鈉，在油浴鍋中50 1:加熱條件下攪拌形成均勻的膠體溶液。
[0007](2)將所得溶液轉(zhuǎn)移到100 mL帶聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，198°C條件下反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后讓反應(yīng)釜自然冷卻至室溫，棄釜內(nèi)上層液體，底部的黑色固體用去離子水沖洗至燒杯中，超聲分散，然后磁分離收集。按照這個(gè)方式水洗2次，乙醇洗2次，所得黑色固體在50 °C條件下干燥。得到的即為氨基化Fe304磁性納米顆粒固體粉末，儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>[0008](3)分別將 Υ(Ν03)3.6H20, Yb (N03) 3.6H20, Er (N03) 3.6H20 配置成 0.5 Μ,0.2Μ, 0.2 Μ的濃度保存?zhèn)溆谩?br>[0009](4)稱取1.2 g NaOH溶于9 mL水中，然后加入10 mL乙醇，20 mL油酸，攪拌形成均質(zhì)透明溶液，在磁力攪拌下向體系中面加入摩爾總量為0.6 mmol的稀土元素(摩爾比Y:Yb:Er = 78:20:2)，隨后向體系中逐滴加入NaF溶液(1.0 M，4 mL)，攪拌約15 min，轉(zhuǎn)移到50 mL容量帶聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，180 °C的烘箱中反應(yīng)8 h。
[0010](5)稱量1.6 g表面活性劑C0-520溶于20 mL環(huán)己燒，攪拌一段時(shí)間后在磁力攪拌下加入已溶于環(huán)己烷(2 mL)中的上裝換納米材料，繼續(xù)攪拌形成透明的反相微乳體系。然后向體系中加入200 yL的100 ΝΗ3.Η20，攪拌一段時(shí)間后加入100 yL的TE0S，20 yL的APTES，在室溫下攪拌24 h0
[0011](6)將5 mg的磁珠分散于5 mL的10 mM PBS中，超聲分散，然后加入L 25 mL 25%的戊二醛溶液，將混合溶液在室溫下孵育緩慢振蕩2 h。磁分離得到的磁性納米材料用PBS
清洗二次。
[0012](7)再取1 mL (1.0 mg/mL的納米材料)向里面加入100 μ L親和素(1.0 mg/mL),在室溫下孵育緩慢振動(dòng)12 h。
[0013](8)稱取10 mg上轉(zhuǎn)換納米材料分散于5 mL 10 mM的PBS (pH 7.4)中，超聲15min讓其充分分散，然后加入1.25 mL 25%的戊二醛溶液，將混合溶液在室溫下?lián)u床中孵育緩慢振蕩2 h。通過離心分離得到上轉(zhuǎn)換納米材料，用10 mM PBS清洗三次。將得到的納米材料重置于5 mL 10 mM PBS中，取1 mL (2.0 mg/mL的納米材料)加入30 μ L氨基修飾的氯霉素適配子互補(bǔ)鏈(10 μ Μ)，在室溫下孵育緩慢振動(dòng)12 h。反應(yīng)結(jié)束之后離心，收集上清溶液，得到的固體用10 mM PBS清洗，然后將偶聯(lián)好的材料溶于1 mL的STE緩沖液中，4°C條件下保存?zhèn)溆谩?br>[0014]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明采用溶劑熱法制備上轉(zhuǎn)換納米材料，采用反相微乳法對(duì)其進(jìn)行氨基修飾，與氨基修飾的氯霉素適配子互補(bǔ)鏈偶聯(lián)得到熒光信號(hào)探針。合成氨基化的磁性納米材料，親和素修飾后與生物素修飾的氯霉素適配子偶聯(lián)得到捕獲探針。
[0015]基于兩段互補(bǔ)鏈的雜交互補(bǔ)配對(duì)原則，兩個(gè)探針形成一個(gè)可以用來檢測(cè)氯霉素的納米復(fù)合物。加入不同濃度的氯霉素后，氯霉素競爭性地與適配子結(jié)合，導(dǎo)致部分上轉(zhuǎn)換納米材料標(biāo)記的互補(bǔ)鏈解離，通過外加磁場(chǎng)分離得到的復(fù)合物的熒光強(qiáng)度也相應(yīng)的發(fā)生變化。
[0016]在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，氯霉素濃度和熒光強(qiáng)度分別在0.01-1 ng/mL和1_10 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，最低檢測(cè)限可以達(dá)到0.01 ng/mL。對(duì)牛奶的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，回收率在93.67%-101.41%范圍內(nèi)。
【附圖說明】
[0017]圖1是實(shí)施例1的上轉(zhuǎn)換納米顆粒紅外光譜圖(a)及氨基化修飾的二氧化硅包裹上轉(zhuǎn)換納米顆粒紅外光譜圖(b)。
【具體實(shí)施方式】
[0018]實(shí)施例1
一種上轉(zhuǎn)換熒光標(biāo)記和磁分離技術(shù)的氯霉素檢測(cè)新方法，包括如下步驟:
(1)一步法制備氨基修飾的納米材料Fe304:分別向圓底燒瓶中加入6.5 g 1，6-己二胺，30 mL乙二醇，1.0 g六水合三氯化鐵和2.0 g無水醋酸鈉，在油浴鍋中50 1:加熱條件下攪拌形成均勻的膠體溶液。
[0019](2)將所得溶液轉(zhuǎn)移到100 mL帶聚四氟乙烯內(nèi)襯的反應(yīng)釜中，198°C條件下反應(yīng)6 h。反應(yīng)結(jié)束后讓反應(yīng)釜自