敵百蟲膠體金試紙條的制備及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及食品中殘留物質(zhì)的檢測(cè)方法，特別是一種敵百蟲膠體金試紙條的制備及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]敵百蟲是用作殺蟲劑。適用于水稻、麥類、蔬菜、茶樹、果樹、桑樹、棉花等作物上的咀嚼式口器害蟲，及家畜寄生蟲、衛(wèi)生害蟲的防治，高效、低毒、低殘留、廣譜性殺蟲劑，以胃毒作用為主，兼有觸殺作用，也有滲透活性。農(nóng)業(yè)上應(yīng)用范圍很廣，用于防治菜青蟲、棉葉跳蟲、桑野蠶、桑黃、象鼻蟲、果樹葉蜂、果蠅等多種害蟲。精制敵百蟲可用于防治豬、牛、馬、騾牲畜體內(nèi)外寄生蟲，對(duì)家庭和環(huán)境衛(wèi)生害蟲均有效。
[0003]我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2003年也頒布了關(guān)于敵百蟲的最大殘留限量，敵百蟲在水果中中最大殘留限量分別為0.1 mg/kg。因此加強(qiáng)對(duì)敵百蟲殘留檢測(cè)技術(shù)的研究，是有效控制水果中藥物殘留的關(guān)鍵措施，也是建立和完善藥物殘留監(jiān)控體系的任務(wù)之一。目前對(duì)敵百蟲的檢測(cè)方法有氣象色譜法，氣-質(zhì)聯(lián)機(jī)和高效液相色譜法，由于以上諸分析法樣品前處理比較復(fù)雜，操作時(shí)需專門的技術(shù)人員、檢測(cè)費(fèi)用昂貴，不利于推廣應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種特異性強(qiáng)，靈敏度高，且操作簡(jiǎn)單方便，對(duì)樣品經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單處理即可檢測(cè)的敵百蟲快速試紙半定量檢測(cè)方法。
[0005]本發(fā)明的目的可通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn):
敵百蟲膠體金試紙條檢測(cè)方法其技術(shù)要點(diǎn)是:試紙的背襯上依次貼有樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，金標(biāo)墊上標(biāo)記的物質(zhì)為第二種屬動(dòng)物蛋白與敵百蟲檢測(cè)用抗原的混合物或第二種屬動(dòng)物蛋白與敵百蟲抗體的混合物；硝酸纖維素膜上包被有敵百蟲抗體1條作為檢測(cè)線，同時(shí)還包被有抗第二種屬動(dòng)物蛋白的IgG 1條作為參考線或包被有敵百蟲檢測(cè)用抗原1條作為檢測(cè)線，同時(shí)還包被有抗第二種屬動(dòng)物蛋白的工IgG 1條作為參考線。在試紙制備時(shí)通過(guò)調(diào)節(jié)檢測(cè)線和參考線包被物的濃度，控制檢測(cè)時(shí)檢測(cè)線和參考線的顯色深淺，并將其顯色深淺與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度對(duì)應(yīng)起來(lái)，達(dá)到半定量檢測(cè)。
[0006]所述的檢測(cè)用抗原是指敵百蟲與載體物質(zhì)明膠形成的偶合物，免疫用抗原是指敵百蟲與載體物質(zhì)匙孔血藍(lán)蛋白(KLH)形成的偶合物。
[0007]所述的載體物質(zhì)也可以選用其他大分子物質(zhì)，如:脂蛋白、多聚氨基酸、葡聚糖、卵清
白蛋白等，但要求檢測(cè)用抗原與免疫用抗原的載體無(wú)交叉免疫反應(yīng)。
[0008]所述的第二種屬動(dòng)物蛋白指非抗體來(lái)源屬動(dòng)物的蛋白，例如，抗體為兔源性，則第二種屬動(dòng)物蛋白可以是卵清白蛋白、豬血清白蛋白等雞、鴨或其他非兔源性動(dòng)物蛋白。
[0009]本發(fā)明所描述的試紙的各部分處理與功能如下:
背襯:為一面涂有不干膠的不吸水的韌性材料，如PVC板，起固定支持試紙其他組成部分的作用。
[0010]樣品墊制備:將濾紙或玻璃纖維紙浸入pH 7.0- 8.4的PBS中約莫2 min，取出，80°C烘干或其他方式干燥，即作為樣品墊，檢測(cè)時(shí)起吸收樣品溶液的作用，便于樣品溶液向上移動(dòng)。
[0011]膠體金標(biāo)記部分的制備:該部分起固定膠體金標(biāo)記的抗原或抗體的作用。
[0012]制備步驟包括膠體金溶液的制備、膠體金標(biāo)記敵百蟲抗原或敵百蟲抗體。
[0013]膠體金標(biāo)記部分處理。
[0014]⑴膠體金溶液的制備:將氯金酸(HAuC14)用超純水配制成1%的母液，取1 mL的母液，用超純水定容至100 mL,配成0.01%的溶液，加熱至沸騰，加入1 - 5 mL 1%的朽1檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱至出現(xiàn)透明的橙紅色為止，即為膠體金溶液。
[0015]⑵膠體金標(biāo)記敵百蟲抗原:將敵百蟲檢測(cè)用抗原和第二種屬動(dòng)物蛋白分別用PBS (0.01mol/L, pH 7.0-7.5)溶解稀釋至 2-4 mg/mL,每 100 mL 膠體金溶液加入 1-3mL 2-4 mg/mL的檢測(cè)用抗原和1-1.5 mL 2-4 mg/mL第二種屬動(dòng)物蛋白震蕩2 min,用0.2mol/L 的 K2C03:，調(diào)節(jié) pH 至 8.4，震蕩 5 min 加入 11% PEG-10000 2 mL，震蕩 5 min,8000-15000r/min 離心 15 min，除去上清，將沉淀用 PBS (0.01 mol/L，pH 7.0_7.5)復(fù)溶，以 6000-13000r/min 離心 15 min,除去上清，將沉淀用 PBS (0.01 mol/L, pH 7.0-7.5)稀釋500-2000倍產(chǎn)物作為金標(biāo)記敵百蟲抗原。
[0016]⑶膠體金標(biāo)記敵百蟲抗體:將敵百蟲單克隆抗體或多克隆抗體和第二種屬蛋白分別用PBS (0.01 mol/L, pH 7.0_7.5)溶解稀釋至2_4 mg/mL，每100 mL膠體金溶液加入1-3 mL 2-4 mg/mL的敵百蟲抗體和1-1.5 mL 2-4 mg/mL第二種屬動(dòng)物蛋白，震蕩2 min,用 0.2 mol/L 的 K2C03，調(diào)節(jié) pH 至 8.4，震蕩 5 min，加 11% PEG-10000 2 mL，震蕩 5 min,8000-15000r/min 離心 15 min，除上清，將沉淀用 PBS (0.01 mol /L, pH 7.0-7.5)復(fù)溶，6000-13000 r/min 離心 15 min，除去上清，將沉淀用 PBS (0.01 mol/L, pH 7.0_7.5)稀釋500-2000倍，產(chǎn)物作為金標(biāo)敵百蟲抗體。
[0017]⑷金標(biāo)墊處理:將敵百蟲抗原或敵百蟲抗體倒入一槽中，將玻璃纖維或?yàn)V紙浸入1min,取出，室溫干燥后，即作為金標(biāo)墊。
[0018]硝酸纖維素膜分制備:用0.8%的戊二醛溶液或0.2%的碳二亞胺溶液浸泡硝酸纖維膜或醋酸纖維膜或尼龍膜30 min，取出，37°C烘干，上邊包被1條不同濃度的敵百蟲檢測(cè)用抗原線或敵百蟲抗體線作為檢測(cè)線，同時(shí)包被1條抗第二種屬動(dòng)物蛋白的工IgG線作為參考線。當(dāng)膠體金標(biāo)記部分標(biāo)記對(duì)象為敵百蟲檢測(cè)用抗原和第二種屬蛋白時(shí)，檢測(cè)線則包