檢測(cè)甲基對(duì)硫磷的時(shí)間分辨熒光免疫試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物檢測(cè)領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種檢測(cè)甲基對(duì)硫磷(MP)的時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]甲基對(duì)硫磷(Parath1n methyl)也叫0，0_ 二甲基_0_對(duì)硝基苯硫代磷酸酯，是一種產(chǎn)量大、應(yīng)用廣的高毒有機(jī)磷酸酯類殺蟲(chóng)劑，由于其毒性較高，近年來(lái)已在蔬菜水果上禁止使用。但在蔬菜生產(chǎn)中仍存在農(nóng)藥亂用、濫用的現(xiàn)象，在農(nóng)產(chǎn)品的進(jìn)出口貿(mào)易、食品安全的監(jiān)督檢測(cè)中，甲基對(duì)硫磷(MP)仍然是常規(guī)檢測(cè)的重點(diǎn)。
[0003]甲基對(duì)硫磷(MP)殘留分析一般使用氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)及氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC/MS)，這些方法靈敏、準(zhǔn)確，可以同時(shí)測(cè)定多種藥物，但需要昂貴的儀器，樣品前處理復(fù)雜、繁瑣費(fèi)時(shí)、檢測(cè)成本較高，而且需專業(yè)人員操作，很難滿足對(duì)樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)、批量、快速檢測(cè)的需要。因此，開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單快速、適用于農(nóng)藥殘留現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控的分析方法具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0004]而時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TR-FIA)由于其特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單、廉價(jià)，且特別適于大批量樣品的檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)而越來(lái)越被人們所重視和采用。目前還沒(méi)有針對(duì)甲基對(duì)硫磷(MP)檢測(cè)的時(shí)間熒光免疫分析法的專利和文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決以上技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種蔬菜水果中甲基對(duì)硫磷(MP)殘留的檢測(cè)時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑盒。
[0006]本發(fā)明的目的之二在于提供一種快速簡(jiǎn)便地檢測(cè)蔬菜水果中甲基對(duì)硫磷(MP)的時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測(cè)方法，用于定量或定性地檢測(cè)蔬菜水果中甲基對(duì)硫磷(MP)殘留量。
[0007]本發(fā)明目的之一是這樣實(shí)現(xiàn)的:檢測(cè)甲基對(duì)硫磷(MP)的時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑盒，其關(guān)鍵在于由多孔包被板、緩沖液、甲基對(duì)硫磷(MP)標(biāo)準(zhǔn)品溶液、抗MP的抗體凍干品、銪標(biāo)記的兔抗鼠抗體、洗滌液和增強(qiáng)液體所組成。
[0008]本發(fā)明目的之二是這樣實(shí)現(xiàn)的:檢測(cè)甲基對(duì)硫磷(MP)的時(shí)間分辨熒光免疫分析試劑盒的檢測(cè)方法，包括免疫原、包被原和單克隆抗體的制備以及樣品前處理及檢測(cè)，其關(guān)鍵在于:
(1)免疫原的制備:將半抗原甲基對(duì)硫磷(MP)與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)，得到免疫原(MP-BSA)；
(2)包被原的制備:將半抗原甲基對(duì)硫磷(MP)與卵血清白蛋白(0VA)偶聯(lián)，得到包被原(MP-0VA)；
(3)單克隆抗體的制備:
a.用步驟(1)的免疫原(MP-BSA)免疫小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)，得到分泌抗MP的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；
b.以體內(nèi)誘生腹水法大量制備抗體，使用ProteinG柱進(jìn)行純化，獲得抗MP的單克隆抗體IgG ；
c.用步驟(2)的包被原包被96孔包被板；
(4)樣品的前處理及檢測(cè):
取包被有包被原(MP-0VA)的多孔包被板，加入50 μ?的ΜΡ到各自的微孔中，加50 μ?以緩沖液稀釋的抗ΜΡ抗體，25°C?37°C振蕩0.5~1小時(shí)，洗滌液洗3次，加以緩沖液稀釋的100 μ? Eu3+ -兔抗鼠抗體，25°C?37°C振蕩0.5~1小時(shí)，洗滌液洗6次，加200 μ?增強(qiáng)液振蕩5分鐘后測(cè)量熒光強(qiáng)度cps，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中的MP含量。
[0009]上述的固相載體是多孔包被板，采用96孔的多孔包被板作為固相載體。
[0010]本發(fā)明主要采用時(shí)間分辨熒光免疫分析方法來(lái)檢測(cè)MP。采用時(shí)間分辨熒光免疫分析法的技術(shù)主要有兩個(gè)方面??第一，特異性單克隆抗體制備，用偶聯(lián)的免疫原免疫小鼠，通過(guò)雜交瘤技術(shù)，得到分泌抗MP的單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株；以體內(nèi)誘生腹水法大量制備抗體，使用Protein G柱進(jìn)行純化,獲得抗MP的單克隆抗體IgG。第二，Eu3+標(biāo)記抗體的制備。
[0011]本發(fā)明測(cè)定方法:測(cè)定的基礎(chǔ)是標(biāo)記免疫反應(yīng)。包被有MP-0VA的多孔包被板，加入測(cè)試樣品到各自的微孔中，再加入抗MP抗體，振蕩反應(yīng)，游離的MP與微孔板上的MP-0VA競(jìng)爭(zhēng)抗MP抗體，洗滌液洗滌，沒(méi)有連接的MP抗體在洗滌步驟中被除去。加入Eu3+-兔抗鼠抗體，進(jìn)行標(biāo)記免疫反應(yīng)，再用洗滌液洗滌，反應(yīng)后沒(méi)有連接的Eu3+-兔抗鼠抗體在洗滌步驟中被除去。加增強(qiáng)液振蕩后，在紫外燈的激發(fā)下發(fā)射很強(qiáng)的熒光，用時(shí)間分辨熒光儀測(cè)定其熒光強(qiáng)度cps，熒光強(qiáng)度與樣品中的濃度成反比，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定樣品中MP的量。
[0012]本發(fā)明檢測(cè)方法不需要昂貴的儀器，樣品前處理簡(jiǎn)單、能現(xiàn)場(chǎng)操作檢測(cè)，應(yīng)用廣泛，該方法靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡(jiǎn)便、特異性強(qiáng)，適用于大批樣品的快速檢測(cè)。
【附圖說(shuō)明】
[0013]圖1為本發(fā)明的甲基對(duì)硫磷(MP)標(biāo)準(zhǔn)品與抗體的TR-FIA標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線圖。
【具體實(shí)施方式】
實(shí)施例
[0014]1、免疫原與包被原制備
本發(fā)明免疫原(MP-BSA)的合成:準(zhǔn)確稱取甲基對(duì)硫磷324mg溶解在2mL N, N- 二甲基甲酰胺中，攪拌下逐滴加入氨基丁酸溶液，攪拌反應(yīng)3小時(shí)，調(diào)節(jié)反應(yīng)液pH 10左右。離心除掉沉淀物。將上述反應(yīng)逐滴加入BSA溶液中(320mg BSA溶解于5mL生理鹽水)，再加入N-羥基琥珀酰亞胺(NHS) 23mg, N, N- 二環(huán)己基碳二亞胺(DCC) 45.4mg，4°C反應(yīng)過(guò)夜，離心除去沉淀，取上清液用磷酸緩沖液(PBS)透析3天，每6小時(shí)更換透析液，將所得產(chǎn)物低壓凍干，于-20°C保存?zhèn)溆茫?br> 包被原(MP-0VA)的合成:在上述反應(yīng)中，將BSA換成0VA后，得到反應(yīng)偶聯(lián)物MP-0VA，該偶聯(lián)物作為TR-FIA檢測(cè)時(shí)作為包被原使用。
[0015]2、單克隆抗體制備
2.1動(dòng)物免疫
用步驟1制備的免疫原分別免疫6周齡雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫劑量為100μδ/0.2mL。首次免疫，用無(wú)菌0.0lmol/L pH7.4 PBS溶解免疫原(MP-BSA)，再與等量弗氏完全佐劑混合，完全乳化，勁背部皮下分2?3點(diǎn)注射；加強(qiáng)免疫，用0.01mol/L pH7.4 PBS溶解免疫原與等量弗氏完全佐劑混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次間隔14?21天，第3次免疫后7?10天開(kāi)始對(duì)免疫小鼠尾靜脈采血，收集血清，用ELISA檢測(cè)小鼠血清效價(jià)。末次免疫后間隔4周以上，在細(xì)胞融合前3?4天，腹腔注射ΜΡ-BSA抗原lOOPg/0.2mL/只，注射后每天注意觀察，保證融合前小鼠狀態(tài)良好。
[0016]2.2單克隆抗體制備
分離免疫小鼠的脾細(xì)胞，并進(jìn)行勻漿制備免疫脾細(xì)胞。取1只免疫的Balb/c小鼠，從眼眶放血分離血清作為陰性血清，處死。小鼠用75%酒精浸泡5min，進(jìn)行整體消毒。將小鼠四肢固定，然后用鑷子夾住小鼠下腹部皮膚，剪開(kāi)一小口，再用鑷子撕開(kāi)皮膚，露出腹膜，換一套鑷子和剪刀，在腹部中央腹膜上用剪刀剪開(kāi)一小口。換一套鑷子和剪刀，用剪刀剪開(kāi)腹膜，露出脾臟，再換一套器械用鑷子夾住脾臟，用剪刀將脾臟外膜剪破，然后放入事先滅菌的勻漿器中。加適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基(RPM1-1640)于勻漿器中，進(jìn)行研磨，擠壓出脾細(xì)胞，取出勻漿器的勻漿棒，再補(bǔ)加適量基礎(chǔ)培養(yǎng)基(RPM1-1640)，靜置2min，將上層細(xì)胞液吸取后，放入腹腔巨噬細(xì)胞離心管中，重復(fù)上述操作1次。1200r/min離心lOmin，除去上清。將10s個(gè)免疫脾細(xì)胞與1?2X107個(gè)SP2/0骨髓瘤細(xì)胞按照1:10或1:5的比例加入離心管中，進(jìn)行混勻，然后于1500r/min水平離心lOmin，棄去上清。將離心管倒扣在滅菌的吸水紙上，把管中液體吸干。用手指或桌面輕輕敲擊管底，讓沉淀的細(xì)胞松動(dòng)，再把離心管置于37°C水浴鍋中。在lmin內(nèi)緩慢將50% PEG 0.8mL滴入離心管中，邊加邊輕輕用吸管尖攪拌沉淀細(xì)胞。再繼續(xù)攪拌30s后，靜置lmin，然后慢慢加入事先進(jìn)行37°C預(yù)溫的40mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基(RPM1-1640)。加基礎(chǔ)培養(yǎng)基方法為:第lmin內(nèi)逐滴滴入lmL，第2min內(nèi)逐滴滴入2mL，第3min內(nèi)逐滴滴入3mL,第4min內(nèi)逐滴滴入4mL,在每次加培養(yǎng)基時(shí)需緩慢加入,并輕輕地?cái)嚢枧囵B(yǎng)基，最后將剩余的RPM1-1640培養(yǎng)基慢慢加入。1000r/min離心5min，除去上清。然后用HAT培養(yǎng)基懸浮混合的細(xì)胞，再加入飼養(yǎng)脾細(xì)胞。根據(jù)需要補(bǔ)加適量的HAT培養(yǎng)基，混合均勻，再將含有飼養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞融合液滴加到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，滴加量約為150?/孔。將培養(yǎng)板置于37 °C、5% C02飽和濕度培養(yǎng)箱中，進(jìn)行培養(yǎng)。用建立的間接ELISA篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆。選擇強(qiáng)陽(yáng)性集落生長(zhǎng)的孔，用有限稀釋法進(jìn)行克隆。并對(duì)其他陽(yáng)性孔，進(jìn)行24孔擴(kuò)大培養(yǎng)，用間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)擴(kuò)大培養(yǎng)孔的上清液進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA均為陽(yáng)性孔的細(xì)胞進(jìn)行液氮冷凍保存。通過(guò)融合檢測(cè)，并進(jìn)行3次亞克隆后獲得雜交瘤細(xì)胞株。雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)過(guò)多次傳代、凍存、復(fù)蘇，雜交瘤細(xì)胞分泌抗體穩(wěn)定。進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞染色體的計(jì)數(shù)，將每株雜交瘤細(xì)胞隨機(jī)選擇20個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行細(xì)胞染色體條數(shù)的計(jì)數(shù)，再計(jì)算細(xì)胞染色體條數(shù)的平均值。小鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)為40條，SP2/0細(xì)胞的染色體數(shù)目平均數(shù)為62~68條，而本試驗(yàn)獲得的20株雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目都在92~103條之間，平均為96.8條。本雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)目高于兩親本細(xì)胞的染色體數(shù)目，說(shuō)明是兩種細(xì)胞的雜交產(chǎn)物。取細(xì)胞株細(xì)胞分泌的培養(yǎng)上清液，進(jìn)行1:10稀釋后，用夾心ELISA方法測(cè)定抗體亞型，該細(xì)胞株分泌的抗體亞型為IgGl。采用辛酸-硫酸銨法對(duì)小鼠腹水進(jìn)行純化。該單克隆抗體可用于制備時(shí)間分辨熒光檢測(cè)試劑盒。
[0017]2.3單克隆抗體的純化
采用辛酸-硫酸銨法對(duì)小鼠腹水進(jìn)行純化:取小鼠腹水10mL，加入等體積的巴比妥緩沖液，適量的二氧化硅混合，室溫振蕩30min。室溫靜置15min后，取上清于潔凈離心管中，4°C, 1800r/min離心20min ;取上清液18mL,加入36mL 0.06mol/L醋酸鈉緩沖液，用HC1調(diào)pH值至4.5，充分?jǐn)嚢柘略?0min內(nèi)緩慢加入辛酸297 μ? ;繼續(xù)攪拌lOmin，然后轉(zhuǎn)入4°C冰箱靜置2h，4°C，15000r/min離心30min，上清液經(jīng)0.45Pm濾膜過(guò)濾后體積為50mL ;加入5mL 0.lmol/L的磷酸緩沖液，用NaOH調(diào)pH值至7.6，攪拌下緩緩加入硫酸銨至終濃度為0.277g/mL ;4°C冰箱靜置 2h 后，4°C, 12000r/min 離心 30min,棄上清；沉淀用 5mL 0.lmol/L的磷酸緩沖液重懸，裝入透析袋，用5000mL 0.01mol/L pH7.2 PBS緩沖液充