一種檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域，特別是檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]氯霉素(chloroamphenicol)是一種廣譜抑菌抗生素,對革蘭陽性、陰性細(xì)菌均有抑制作用。因其抗菌效果好而長期廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖業(yè)。其抑菌機理為通過可逆地與50S亞基結(jié)合，阻斷轉(zhuǎn)肽酰酶的作用，干擾帶有氨基酸的胺基酰-tRNA終端與50S亞基結(jié)合，從而使新肽鏈的形成受阻，抑制蛋白質(zhì)合成。但由于氯霉素還可與人體線粒體的70S結(jié)合，因而也可抑制人體線粒體的蛋白合成，對人體產(chǎn)生毒性，嚴(yán)重者能抑制人體骨髓造血功能而引起再生障礙性貧血癥和粒細(xì)胞性白血病等疾病，因此動物源食品中的氯霉素殘留將對人類的健康構(gòu)成巨大的潛在危害。世界糧農(nóng)組織和衛(wèi)生組織對食品中氯霉素的殘留量的規(guī)定由原來的?ο μ g/kg降為0.1 μ g/kg。我國農(nóng)業(yè)部于2002年發(fā)布的《食品動物禁用獸藥及其化合物清單》中亦正式將氯霉素及其鹽酯等制劑列為禁用藥物。但是，由于個別養(yǎng)殖戶不顧國家禁令繼續(xù)使用該抗生素，使得動物源食品的食用安全存在隱患。
[0003]目前，因檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠，氯霉素的測定多采用色譜法，但色譜法對儀器設(shè)備的要求較高，且樣本前處理過程比較復(fù)雜，為了節(jié)省成本，快速高效的檢測樣本中的氯霉素殘留，本發(fā)明建立了一種檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，該方法靈敏、準(zhǔn)確、快速，操作簡便、特異性強，適用于大批樣品的快速檢測。
[0004]本發(fā)明一種檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒，內(nèi)含酶標(biāo)板、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品、氯霉素抗體工作液、氯霉素酶標(biāo)二抗工作液、底物液A、底物液B、終止液、濃縮復(fù)溶液和濃縮洗滌液。
[0005]本發(fā)明一種檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒的制備，包括酶標(biāo)板的制備、氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品的制備、氯霉素抗體工作液的制備、氯霉素酶標(biāo)二抗工作液的制備、底物液A的制備、底物液B的制備、終止液的制備、濃縮復(fù)溶液的制備和濃縮洗滌液的制備。
[0006]其進一步特征在于:所述的酶標(biāo)板經(jīng)由氯霉素抗原包被制備，具體步驟是將氯霉素半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到包被抗原，用0.05 mol/L pH 7.2的磷酸鹽(PBS)緩沖液作為包被液，將氯霉素包被抗原稀釋成1:60000比例，100 μ L/孔，37°C避光孵育2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，加入經(jīng)稀釋的濃縮洗滌液300 μ L/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉液，150 μ L/孔，37°C放置1.5 h，甩掉封閉液直接拍干，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封于4°C條件下保存。
[0007]氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0 ng/mL、0.01 ng/mL、0.03 ng/mL、0.09 ng/mL、0.81ng/mL、2.43 ng/mL。
[0008]所述氯霉素抗體工作液是采用氯霉素人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1:80000比例制備。
[0009]所述氯霉素酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1:4000比例，所述底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氣脲的梓檬酸-磷酸氣二鈉緩沖溶液，所述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，所述終止液為2 mol/L的硫酸，所述濃縮復(fù)溶液是10倍濃縮復(fù)溶液，為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，所述濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含 0.5% 吐溫-20，0.1 mol/L 的 PBST, pH 值范圍 7.0-7.5 之間。
[0010]檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法，基于抗原抗體的間接競爭酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理，該方法檢測步驟如下:
取包被有氯霉素抗原的酶標(biāo)板，按序分別加入標(biāo)準(zhǔn)品/樣本、氯霉素酶標(biāo)二抗工作液、氯霉素抗體工作液各50 μ L/孔到對應(yīng)的微孔中，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置室溫25°C避光環(huán)境中反應(yīng)30 min，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液充分洗滌4~5次，每次間隔10s,拍干后加入底物液A 50 μ L/孔,底物液B 50 μ L/孔,輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15?20 min,加入終止液50 μ L/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450 nm處或雙波長450/630 nm檢測，測定每孔吸光度值(請在5 min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，以的標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ppb)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中氯霉素的含量。
[0011]其中，所述待測樣品用以下方法進行預(yù)處理:
(1)牛奶0.25ng/ml將牛奶離心去除上層脂肪，取2 mL已去除脂肪的牛奶樣本加入4mL乙酸乙酯，渦旋混勻后離心，取上層有機相2 mL于50 ~60 °C水浴氮氣吹干，加入1 mL正已烷溶解殘留物，并加入1 mL樣品復(fù)溶液，充分振蕩混勻后離心，去除上層正己烷相以及兩相之間的泡沫或者膠狀物，余下層水相待測；
(2)組織1.5ng/g準(zhǔn)確稱取2g均值后的樣品于離心管中，先加入2 mL去離子水充分混勻再加入4 mL乙酸乙酯，渦旋混勻后離心，取上層有機相2 mL于50 ~60 °C水浴氮氣吹干，加入1 mL正已烷溶解殘留物，并加入1 mL樣品復(fù)溶液，充分振蕩混勻后離心，去除上層正己烷相以及兩相之間的泡沫或者膠狀物，余下層水相待測；
(3)血清0.5ng/ml取2 mL血清加入4 mL乙酸乙酯渦旋混勻后離心，取上層有機相2mL于50 ~60 °C水浴氮氣吹干，加入1 mL樣品復(fù)溶液混勻待測；
(4)蜂蜜(快檢)1.5ng/g準(zhǔn)確稱取2g樣品于離心管中，加人2m L去離子水，渦旋混合至試樣完全溶解后加人4 mL乙酸乙醋，渦旋混勻后離心，取上層有機相2 mL于50 ~60°C水浴氮氣吹干，加入1 mL正已烷溶解殘留物，并加入1 mL樣品復(fù)溶液，充分振蕩混勻后離心，去除上層正己烷相以及兩相之間的泡沫或者膠狀物，余下層水相待測。
[0012]本發(fā)明一種檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒及其檢測方法的測定原理:樣品中的氯霉素與酶標(biāo)板上固定的抗原特異性競爭抗體，加入酶標(biāo)二抗，與抗體反應(yīng)，通過酶催化顯色劑顯色，根據(jù)顯色的深淺來判斷樣品中氯霉素的含量。如果樣品中的氯霉素含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發(fā)明的試劑盒檢測方法操作簡便，檢測靈敏、準(zhǔn)確、快速，適用于大批量樣品的快速檢測。
【具體實施方式】
[0013]氯霉素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物采用琥珀酸酐法將氯霉素半抗原與載體蛋白BSA偶聯(lián)制備。
[0014]氯霉素抗體的制備:
選用健康成年純種BALA/C小鼠，取與蛋白質(zhì)偶聯(lián)制備的免疫抗原50μ g與等量完全弗氏佐劑混合采用腹腔注射進行初次免疫，之后每隔3周用相同劑量免疫抗原加等量不完全弗氏佐劑采用腹腔注射進行二次、三次免疫，每次免疫6天后尾靜脈采血測定抗血清效價至一定滴度后，用相同劑量不加佐劑進行末次免疫，3天后取脾制備脾細(xì)胞懸浮液與骨髓瘤細(xì)胞進行細(xì)胞融合，篩選出所需要的雜交瘤細(xì)胞系進行克隆化，選擇處于對數(shù)生長期的雜交瘤細(xì)胞進行凍存，用于腹水制備，先腹腔注射0.5 ml液體石蠟于BALB/C鼠致敏，2周后腹腔注射1X106個雜交瘤細(xì)胞，接種細(xì)胞7-10天后可產(chǎn)生腹水，待腹水盡可能多時用注射器抽取腹水，反復(fù)收集數(shù)次，4000 rpm離心15 min,收集上清，采用辛酸-硫酸銨法純化腹水對單克隆抗體進行純化，冷凍干燥得凍干粉后于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0015]制備包被有氯霉素包被抗原的酶標(biāo)板:
包被抗原是將氯霉素半抗原與載體蛋白牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)得到的，用0.05mol/L pH 7.2的磷酸鹽(PBS)緩沖液作為包被液，將氯霉素抗原稀釋成1:60000比例，100?/孔，37 °C放置2 h，取出酶標(biāo)板甩掉板內(nèi)液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 μ?/孔，洗板2次，30 s/次，然后加入0.5%牛血清白蛋白(BSA)封閉，150 μ?7孔，37°C放置1.5 h，棄去封閉液，拍干后的酶標(biāo)板放置恒溫間(25°C)晾干，抽檢合格后將酶標(biāo)板真空密封后置4°C下保存。
[0016]氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為0 ng/mL、0.01 ng/mL、0.03 ng/mL、0.09 ng/mL、0.81 ng/mL、2.43 ng/mL
[0017]氯霉素抗體工作液的制備:采用氯霉素人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1:80000比例制備。
[0018]氯霉素酶標(biāo)二抗工作液由酶標(biāo)二抗加稀釋液稀釋成1:4000比例，底物液A為含有0.5 mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液，底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液，終止液為2 mol/L的硫酸，濃縮復(fù)溶液是10倍濃縮復(fù)溶液，為0.1 mol/L的PBS，pH值范圍7.0-7.5之間，濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，為含0.5%吐溫-20，0.01mol/L的PBST, pH值范圍7.0-7.5之間。
[0019]基于上述制備的試劑，本發(fā)明用于檢測氯霉素的酶聯(lián)免疫試劑盒包括如下材料:
(1)96孔酶標(biāo)板XI塊；
(2)標(biāo)準(zhǔn)液X 6 瓶:(lmL/瓶)0 ppm、0.01 ng/mL、0.03 ng/mL、0.09 ng/mL、0.81 ng/mL、2.43 ng/mL ；
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