用于AChE的組合物、篩選AChE抑制劑方法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，具體涉及一種用于乙酰膽堿酯酶（AChE)的組合物、篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002]AChE (乙酰膽堿酯酶)是一種可以在膽堿神經(jīng)突觸催化分解乙酰膽堿的酶，使突觸傳遞終止。很多研究已證實AD小鼠腦脊液中AChE水平顯著降低，低水平的AChE與一定程度的認(rèn)知障礙顯著相關(guān)。小鼠腦脊液中低水平AChE可能表明大腦處于風(fēng)險或者個體正處于AD的臨床癥狀前階段。由于現(xiàn)有的AD確診不僅需要存在嚴(yán)重的認(rèn)知功能缺損，而且需要證實存在典型的腦組織病理學(xué)改變，這些信息對于早期阻斷和治療疾病就非常有用?，F(xiàn)在尚無準(zhǔn)確的方法在早期無癥狀階段識別AD，越來越多的證據(jù)表明，使用腦脊液（CSF)生物標(biāo)記物本身（β_淀粉樣蛋白，全蛋白和磷酸化tau蛋白水平）或者與神經(jīng)影像學(xué)結(jié)合，可為AD的臨床診斷提供有效的信息。CSF中AChE的水平與AD認(rèn)知進程的相關(guān)性，可以作為一個重要的參數(shù)應(yīng)用于監(jiān)測AD進程和治療效果，尤其是同時結(jié)合其他CSF生物標(biāo)記物和神經(jīng)影像學(xué)檢查。因此開發(fā)可靠的方法來檢測CSF中AChE的水平十分重要。
[0003]傳統(tǒng)方法檢測AChE水平包括使用Ellman試劑的比色法，和檢測乙酰膽堿酯酶氧化膽堿產(chǎn)生的過氧化氫，這兩個方法均靈敏度低且需要大量時間。為了提高靈敏度，增強的化學(xué)方法，如基于有機化合物和量子點的電化學(xué)探針和化學(xué)發(fā)光或者熒光檢測AChE，起到了重要作用。然而這些方法仍然靈敏度較低且需要繁瑣的化學(xué)合成步驟。
[0004]已報道兩種基于AuNP(納米金）比色法檢測AChE，一種是基于AuNP的聚集，會導(dǎo)致紅色吸收帶的紅移，以及從紅色到藍(lán)色的顏色變化；另一種依賴于AChE催化的單分散AuNPs尺寸的擴大。然而，研究者仍然面臨提高試驗靈敏度和準(zhǔn)確性的挑戰(zhàn)，更重要的是，沒有報道評估它們在實際復(fù)雜混合物樣品，如CSF或血清分析中的應(yīng)用。因此，開發(fā)具有高靈敏度和特異性的檢測AChE實際樣本方法有很大需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明需要解決的現(xiàn)有技術(shù)的問題是：現(xiàn)有的用于乙酰膽堿酯酶分析以及篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法，其靈敏度和準(zhǔn)確性較低且需要繁瑣的化學(xué)反應(yīng)步驟，而且不合適應(yīng)用于復(fù)雜的樣品中。
[0006]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種乙酰膽堿酯酶分析用的組合物、用于篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法以及用途。
[0007]具體而言，本發(fā)明提供了一種乙酰膽堿酯酶分析用的組合物，包括羅丹明素、納米金和乙酰膽堿酯酶的作用底物。
[0008]優(yōu)選的，所述的羅丹明素、所述納米金以及所述乙酰膽堿酯酶的作用底物的摩爾比為:800 ?1800:5 ： 10000 ?40000，優(yōu)選摩爾比為 1000 ?1600 ：5:10000 ?30000，更優(yōu)選摩爾比為 1000 ?1400 ：5:15000 ?20000。
[0009]優(yōu)選的，所述的納米金為檸檬酸修飾的納米金。
[0010]優(yōu)選的，所述的納米金的粒徑大小為10nm?80nm，優(yōu)選為10?40nm，更優(yōu)選為13 ?20nm。
[0011]優(yōu)選的，所述乙酰膽堿酯酶的作用底物為碳數(shù)子數(shù)為2-6個的羧酸?；哪憠A類化合物及其類似物；優(yōu)選為乙酰膽堿及其類似物，丙酰膽堿及其類似物，丁酰膽堿及其類似物；更優(yōu)選為乙酰膽堿及其類似物。
[0012]其中，本發(fā)明中的乙酰膽堿酯酶可以作用于乙酰膽堿酯酶的作用底物，特異性的斷開乙酰膽堿酯酶作用底物中的酯鍵，生成碳原子數(shù)為2-6個的羧酸和膽堿類化合物或者其類似物。
[0013]優(yōu)選的，所述的碳數(shù)子數(shù)為2-6的羧酸?；哪憠A類化合物的類似物為碳數(shù)子數(shù)為2-6個的羧酸?；哪憠A類含鹽類似物或者碳原子數(shù)為2-6個的羧酸?；哪憠A類受體類似物；優(yōu)選為乙酰膽堿含鹽類似物，乙酰膽堿受體類似物，丙酰膽堿含鹽類似物，丙酰膽堿受體類似物，丁酰膽堿含鹽類似物，丁酰膽堿受體類似物；更優(yōu)選為乙酰膽堿含鹽類似物或乙酰膽堿受體類似物；進一步優(yōu)選為乙酰膽堿含磷類似物。
[0014]優(yōu)選的，所述組合物為含有羅丹明素、納米金和乙酰膽堿酯酶的作用底物的緩沖溶液。
[0015]優(yōu)選的，所述的緩沖溶液的pH值為9.0-11.0，優(yōu)選pH值為10.0，更優(yōu)選為碳酸氫鈉-氫氧化鈉的緩沖溶液。
[0016]本發(fā)明同時提供了一種用于篩選乙酰膽堿酯酶抑制劑的方法，包括如下步驟:
[0017](1)將樣本置于含有羅丹明素、納米金、乙酰膽堿酯酶的作用底物的溶液中反應(yīng)；
[0018](2)利用紫外吸收的方法，測定溶液的吸收值；
[0019]以及
[0020](3)采用熒光檢測，測定溶液的熒光值。
[0021]優(yōu)選的，所述的紫外吸收檢測波長范圍為400?800nm。
[0022]優(yōu)選的，所述的熒光檢測的激發(fā)波長范圍為540nm?560nm，吸收波長范圍為560 ?580nm。
[0023]本發(fā)明還通過了以上所述的組合物或以上所述的方法在硫代膽堿含量測定領(lǐng)域、乙酰膽堿酯酶分析領(lǐng)域或者在乙酰膽堿酯酶抑制劑篩選領(lǐng)域中的用途。
[0024]本發(fā)明的檢測原理為:RB(羅丹明素)可溶于水、耐光、有強烈的熒光，且容易吸附到金納米粒子的表面導(dǎo)致熒光淬滅。RB分子上帶正電荷的氨基能夠通過靜電相互作用識別帶負(fù)電荷的檸檬酸-AuNPs，從而連接到AuNPs的表面。同時RB分子的熒光被AuNPs淬滅。此時若加入乙酰膽堿類似物(acetylth1choline，ATC)和AChE到RB_AuNPs溶液中，AChE可以水解ATC形成硫代膽堿，硫代膽堿通過形成Au - S鍵替代RB分子，緊密結(jié)合到AuNPs表面，導(dǎo)致RB分子從Au表面脫離，釋放出熒光。同時，吸附到不同AuNP表面的硫代膽堿和RB分子可以通過硫代膽堿上的季銨基團和RB分子上的酸性基團之間的靜電相互作用發(fā)生反應(yīng)，引起AuNPs聚集。這個過程導(dǎo)致吸收光譜帶的快速變化，同時AuNPs溶液的顏色由紅色變?yōu)樗{(lán)色。另外，如果存在AChE抑制劑，AChE就無法水解ATC產(chǎn)生硫代膽堿來引起RB-AuNPs聚集或恢復(fù)RB分子的熒光。
[0025]應(yīng)用以上原理，本發(fā)明提供了一個使用RB-AuNPs篩選AChE抑制劑的高靈敏度檢測方法，同時驗證了它在檢測轉(zhuǎn)基因AD小鼠CSF中AChE的效用。
[0026]基于羅丹明素納米金（RB-AuNP)的雙讀數(shù)（比色和熒光）檢測，其靈敏度高、特異性強，可以應(yīng)用于監(jiān)測阿爾茨海默氏?。ˋD)小鼠腦脊液（CSF)中乙酰膽堿酯酶（AChE)的含量。由于分子的變化可以容易轉(zhuǎn)化為顏色變化，從而被吸光度或表面等離子體共振改變識別，所以使用AuNP比色進行檢測成為強有吸引力的檢測方式。
[0027]本發(fā)明的有益效果是：
[0028](1)本發(fā)明通過AuNP溶液的顏色改變和RB分子的熒光恢復(fù)可以作為檢測復(fù)雜樣本中AChE的含量的有效工具。
[0029](2)本發(fā)明的方法可以應(yīng)用于篩選AChE抑制劑，如果存在AChE抑制劑，AChE就無法水解ATC產(chǎn)生硫代膽堿來引起RB-AuNPs聚集或恢復(fù)RB分子的熒光。
[0030](3)本發(fā)明采用雙信號輸出是一個顯著的進步，而且雖然巰基化合物與硫代膽堿類似，可從AuNPs表面釋放RB分子，引起熒光恢復(fù)，但是巰基化合物并不能引起肉眼可見的AuNPs聚集。因此如果滿足熒光恢復(fù)和溶液顏色變化兩個條件，必須滿足可以指示硫代膽堿的條件。這個要求有效的避免了來自巰基化合物的干擾，因此保證了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。兩個信號的輸出，包括AuNP溶液的顏色改變和RB分子的熒光恢復(fù)，能夠有效的用于避免假陽性信號。
[0031]下面結(jié)合附圖和各個【具體實施方式】，對本發(fā)明及其有益技術(shù)效果進行詳細(xì)說明，其中：
【附圖說明】
[0032]圖la為本發(fā)明