一種uht滅菌乳中復(fù)原乳的鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種乳制品檢測方法，具體地說是一種UHT滅菌乳中復(fù)原乳的鑒別方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在液態(tài)奶中大量使用進(jìn)口乳粉，是發(fā)展中國家乳品消費(fèi)處于快速增長時期的特有 現(xiàn)象。加工企業(yè)用乳粉生產(chǎn)復(fù)原乳（reconstitutedmilk，將干燥的或者濃縮的乳制品與水 按比例混勻后獲得的乳液）操作方便，風(fēng)險低，不需要建設(shè)奶源基地，但是嚴(yán)重?fù)p害了農(nóng)民 的利益，侵犯了消費(fèi)者的知情權(quán)。更為嚴(yán)重的是，復(fù)原乳完全割斷了加工企業(yè)與養(yǎng)殖戶之間 共同提高原料奶質(zhì)量的責(zé)任關(guān)系，使進(jìn)口乳粉成為我國的境外奶源基地。
[0003] 目前國際組織和國外都沒有頒布用于復(fù)原乳鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，國際上將經(jīng)過熱殺菌的 多種液態(tài)奶，分別命名為"巴氏殺菌奶"、"高溫巴氏殺菌奶"、"超巴氏殺菌奶"、"延長保質(zhì)期 的奶"、"直接法超高溫滅菌奶"、"間接法超高溫滅菌奶"、"保持法滅菌奶"等不同品類，以示 相互區(qū)分。我國現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)只命名了其中的三個，即巴氏殺菌奶、超高溫滅菌奶（間接法）和 保持法滅菌奶。因此，有必要開發(fā)一種鑒定UHT滅菌乳中復(fù)原乳的方法，促進(jìn)乳品行業(yè)的健 康發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明針對不添加營養(yǎng)強(qiáng)化劑和/或乳糖水解酶，或僅添加礦物質(zhì)、維生素的UHT 滅菌乳。復(fù)原乳鑒定是世界性的難題。在國內(nèi)外無同類標(biāo)準(zhǔn)可以借鑒的情況下，本發(fā)明創(chuàng)新 性提出了復(fù)原乳鑒定方法，并針對我國實際情況建立起區(qū)分含復(fù)原乳產(chǎn)品的方法，不僅為 我國復(fù)原乳監(jiān)管奠定了技術(shù)基礎(chǔ)，而且推動我國在該領(lǐng)域的技術(shù)創(chuàng)新處于國際先進(jìn)水平。 本發(fā)明進(jìn)一步提高了乳制品檢測方法的權(quán)威性，保障消費(fèi)者知情權(quán)、保護(hù)奶農(nóng)利益、促進(jìn)民 族奶業(yè)健康發(fā)展等方面更好地發(fā)揮作用。
[0005] 本發(fā)明中的生乳（rawmilk)是指從健康奶畜擠下的經(jīng)過或不經(jīng)過過濾和冷卻，但 未經(jīng)過任何加熱和其他除菌處理的常乳。乳粉包括全脂、脫脂、部分脫脂等不同類型，此外 乳清粉、濃縮乳也可能被企業(yè)用于液態(tài)奶生產(chǎn)。復(fù)原乳（reconstitutedmilk)是指將干燥 的或者濃縮的乳制品與水按比例混勻后獲得的乳液。本發(fā)明將"熱處理"具體定義為"采用 加熱技術(shù)且強(qiáng)度不低于巴氏殺菌、殺滅和抑制生乳中微生物生長使得堿性磷酸酶呈陰性， 同時控制其物理化學(xué)性狀只發(fā)生有限變化的操作統(tǒng)稱"。本發(fā)明將"超高溫瞬時滅菌（UHT) " 具體定義為經(jīng)135°C以上滅菌數(shù)秒。
[0006] 下面對糠氨酸、乳果糖含量的測定方法進(jìn)行描述。
[0007] (一）糠氨酸含量的測定方法：
[0008] 牛奶在加熱過程中梅拉德反應(yīng)，使蛋白質(zhì)和糖生成糠氨酸（ε-Ν-2-呋喃甲 基-L-賴氨酸）。試樣經(jīng)鹽酸水解后測定蛋白質(zhì)含量，水解液經(jīng)C18萃取，用高效液相色譜 (HPLC)或超高效液相色譜（UPLC)在紫外（280nm)檢測器下對糠氨酸樣品進(jìn)行分析，以外標(biāo) 法定量糠氨酸。最后計算每百克蛋白質(zhì)中糠氨酸的含量。需要說明的是，本發(fā)明對糠氨酸 含量的測定方法中僅使用確認(rèn)為分析純的試劑和GB/T6682中一級水。
[0009] 本發(fā)明糠氨酸含量測定方法所使用的試劑為：
[0010] 甲醇（CH30H):色譜純。
[0011] 3mol/L鹽酸溶液：在7.5mL水中加入2.5mL濃鹽酸（12mol/L)，混勻。
[0012]10. 6mol/L鹽酸溶液：在12mL水中加入88mL濃鹽酸（12mol/L)，混勻。
[0013] 0· 1%三氟乙酸溶液：吸取lmL三氟乙酸（色譜純）溶于水中，定容至1L，超聲波 脫氣35min〇
[0014] 6g/LKC1溶液（m/v):準(zhǔn)確稱量6gKC1溶于部分水中，定容至1L，過0. 45μm水 相濾膜，超聲波脫氣35min。
[0015] 糠氨酸（furosine) (ε-N- (2-呋喃甲基）-L-賴氨酸）標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液：將糠氨酸標(biāo) 準(zhǔn)物按其純度換算后，用3mol/L鹽酸溶液配制成200μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液，-20°C條件下 可貯存24個月。
[0016] 糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：微量移液器吸取250μL標(biāo)準(zhǔn)貯備溶液于25mL容量瓶，以 3mol/L鹽酸溶液定容，配制成2μg/mL糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。
[0017] 高純度氮?dú)猓?9· 99%。
[0018] 本發(fā)明糠氨酸含量的測定方法使用的儀器為：
[0019] 高效液相色譜儀：配有梯度洗脫系統(tǒng)及紫外檢測器或二極管陣列檢測器。
[0020] 凱氏定氮儀。
[0021] C18萃取柱：柱容量500mg。
[0022] 干燥箱：110°C±2°C。
[0023] 密封耐熱試管：容積為20mL。
[0024]注射器：10mL。
[0025] 容量瓶：容積分別為25mL和1L。
[0026] 超高效液相色譜儀：配有紫外檢測器或二極管陣列檢測器。
[0027] 有機(jī)相濾膜：0.45μ m。
[0028]水相濾膜：0.45μ m。
[0029] 糠氨酸含量的測定步驟如下：
[0030] 步驟一、采樣：取不少于200mL液態(tài)奶作為實驗樣品，將樣品在0°C~4°C條件下保 存。
[0031] 步驟二、水解液的制備：吸取2.OOmL試樣，置于密閉耐熱試管中，加入6mL的 10. 6mol/L鹽酸溶液，混勻，往試管中緩慢通入所述高純度氮?dú)鈒min~2min，密閉試管，將 試管置于干燥箱，在ll〇°C下加熱約lh后，輕輕搖動試管，繼續(xù)加熱直至加熱23h~24h。加 熱結(jié)束后，將試管從干燥箱中取出，冷卻后過濾，制得水解液。
[0032] 步驟三、水解液中蛋白質(zhì)含量的測定：吸取2.OOmL步驟二制得的水解液，按GB/T 5009. 5測定試樣溶液中蛋白質(zhì)含量。
[0033] 步驟四、水解液的純化：將C18萃取柱安裝在注射器上。分別用5mL甲醇和10mL 水潤濕萃取柱，保持萃取柱濕潤狀態(tài)。吸取0. 500mL步驟二中水解液于萃取柱，用注射器緩 慢推入C18萃取柱內(nèi)。吸取3mol/L鹽酸溶液緩慢洗脫萃取柱中的樣品至3mL。
[0034] 步驟五、糠氨酸含量的測定：該步驟采用以下兩種方法測定。（a)HPLC法；(b)UPLC 法。
[0035] (a)HPLC法：
[0036] 1)色譜參考條件
[0037] 色譜柱：C18硅膠色譜柱，250_X4. 6mm，5μπι粒徑，或相當(dāng)者。
[0038] 柱溫：32Γ。
[0039] 流動相：0. 1 %三氟乙酸溶液（5. 1. 2. 4)為流動相Α，甲醇（5. 1. 2. 1)為流動相Β。
[0040] 洗脫梯度：見表1。
[0041] 表1洗脫梯度
[0042]
[0043] 2)測定
[0044] 利用流動相Α和流動相Β的混合液（50 : 50)以lmL/min的流速平衡色譜系統(tǒng)。 注入20μL~50μL的3mol/L鹽酸溶液平衡柱子，以檢測溶劑的純度。注入10μL待測 溶液（步驟四得到的純化后的水解液）測定糠氨酸含量。
[0045] (b)UPLC法
[0046] 1)色譜參考條件
[0047] 色譜柱：WATERSACQUITYUPLC⑩HSST3 色譜柱 1. 8μm(100mmX2. 1mm)，或相 當(dāng)者。
[0048] 柱溫：30Γ。
[0049] 流動相：6g/LKC1溶液為流動相A，甲醇為流動相B，純水為流動相C。
[0050] 洗脫條件：流動相A，0· 4mL/min。
[0051] 2)測定
[0052] 分別利用流動相B、C、A以0. 4mL/min的流速依次平衡色譜系統(tǒng)。注入2μL~5μL 的3mol/L鹽酸溶液平衡柱子，以檢測溶劑的純度。注入2yL待測溶液（步驟四得到的純 化后的水解液）測定糠氨酸含量。
[0053] 步驟六、糠氨酸含量計算結(jié)果：糠氨酸含量以質(zhì)量分?jǐn)?shù)W計，數(shù)值以毫克每百克蛋 白質(zhì)（mg/ΙΟΟε蛋白質(zhì)）表τκ,按公式⑵計筧：
[0054]
[0055] 式中：
[0056] W樣品中糖氣酸含量，單位為暈克每百克蛋白質(zhì)（mg/lOOg蛋白質(zhì)）；
[0057]AJ!〗試樣品中糠氨酸峰面積的數(shù)值；
[0058] Astd糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液中，糠氨酸峰面積的數(shù)值；
[0059] Cstd糠氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，單位為mg/L;
[0060] D測定時稀釋倍數(shù)（D= 6);
[0061] m樣品水解液中蛋白質(zhì)濃度，單位為克每升（g/L)。
[0062] 計算結(jié)果保留至小數(shù)點后一位。
[0063] 本發(fā)明中，上述糠氨酸含量的測定方法精密度控制如下：
[0064] 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對差值不大于算術(shù)平均值的10%， 在重現(xiàn)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測試結(jié)果的絕對差值不大于算術(shù)平均值的20%。上述 HPLC和UPLC檢測方法的檢測限和定量限分別如表2所示。
[0065] 表2HPLC和UPLC的檢測限和定量限
[0066]
[0067](二）乳果糖含量的測定
[0068] 奶樣中加入硫酸鋅和亞鐵氰化鉀溶液，沉淀脂肪和蛋白質(zhì)。濾液中加入 員-〇-半乳糖苷酶（0-83]^1：〇81(^86)，在0-〇-半乳糖苷酶作用下乳糖水解為半乳糖 (galactose)和葡萄糖（glucose);乳果糖水解為半乳糖（galactose)和果糖（fructose):
[0069]
[0070] 但牛奶中乳糖含量比乳果糖含量高得多（約100倍），水解生成的大量葡萄糖干擾 果糖的測定。為此，再加入葡萄糖氧