一種用于檢測眼科疾病的試劑盒及其檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種用于檢測眼科疾病的試劑盒及其檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 格雷夫斯病（Graves' disease)是一種常見病，女性發(fā)病率為1/1000人/年。除 甲狀腺功能亢進(jìn)以外，25-50%患有格雷夫斯病的個(gè)體病情發(fā)展到在臨床上累及眼睛，即甲 狀腺眼病。格雷夫斯眼?。℅raves' Ophthalmopathy, G0或ΤΑ0)是甲狀腺眼病的典型形 式。雖然一些G0患者只患有輕微的眼睛不適，但是3-5%患有劇烈疼痛和炎癥伴有復(fù)視乃 至視力喪失。目前由于本病原因未明，臨床主要以激素、免疫抑制劑、生長激素類似物、抗甲 狀腺藥物、眶內(nèi)放射、眼眶減壓術(shù)等綜合治療為主，但由于種種原因，效果并不盡人意，迄今 為止尚無任何一種藥物能有效治療ΤΑ0,并獲長期緩解。因此，研究治療甲狀腺相關(guān)眼病的 藥物是亟待解決的技術(shù)問題。而檢測所述疾病更是本領(lǐng)域積極研究的方向。
[0003] 近年來的研究表明，人瘦素蛋白（rh-Ι印tin)對ΤΑ0患者眼眶前脂肪成纖維細(xì)胞 增殖、移行以及細(xì)胞分化過程中細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)形成具有重要的作用。因此，檢測人瘦素蛋白的 表達(dá)情況，可以直接用于鑒定甲狀腺相關(guān)眼病。然而傳統(tǒng)的檢測人瘦素蛋白的表達(dá)情況具 有操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)的缺點(diǎn)。
[0004] 核酸適體（Aptamer,又稱適配體，適配子)是能高親和性、高特異性的結(jié)合某種生 物革E1標(biāo)的單鏈寡核酸分子（ssDNA或ssRNA)。核酸適體是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技 術(shù)（Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, SELEX)從人工合 成的DNA/RNA文庫中篩選得到的能夠高度特異性結(jié)合靶標(biāo)分子的單鏈DNA/RNA。已報(bào)道核 酸適體的靶標(biāo)包括金屬離子、有機(jī)小分子、多肽、蛋白質(zhì)、細(xì)胞甚至組織等。核酸適體的分子 識別功能與抗體類似，具有與抗體分子相當(dāng)甚至更強(qiáng)的靶標(biāo)識別能力，但與抗體相比具有 很多優(yōu)良的特性，如分子量小，能批量生產(chǎn)，不易失活，無免疫原性、容易合成與標(biāo)記、快速 的穿透組織、良好的代謝動力學(xué)、不同批次之間產(chǎn)品不會存在差異和具有很好化學(xué)穩(wěn)定性， 在生物檢測、疾病診斷治療等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是提供一種特異結(jié)合1印tin的核酸適體及其試劑盒。
[0006] 本發(fā)明提供的核酸適體，是序列表的序列1-15所示的單鏈DNA。
[0007] 所述核酸適體與leptin蛋白具有較好的親和能力。
[0008] 還可將所述核酸適體進(jìn)行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物。
[0009] 所述核酸適體的衍生物可為如下任意一種： a) 將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補(bǔ)的核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相 同功能的核酸適體的衍生物； b)將所述核酸適體進(jìn)行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能 的核酸適體的衍生物； C)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功 能的核酸適體的衍生物； d) 將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生 物； e) 將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質(zhì)后，得到的與所述核酸適體具有 相同功能的核酸適體的衍生物。
[0010] 所述核酸適體可用于制備檢測1印tin的試劑盒。
[0011] 利用本發(fā)明的核酸適體，可以捕獲血液中的leptin，從而用于甲狀腺相關(guān)眼病篩 查。利用本發(fā)明的核酸適體，部分代替單克隆抗體捕獲leptin進(jìn)行檢測，具有高靈敏、成本 低、易制備、易保存的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0012] 以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn) 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0013] 實(shí)施例1、核酸適體的篩選和制備 設(shè)計(jì)兩端包含大約20個(gè)核苷酸、中間包括39個(gè)核苷酸的隨機(jī)核酸文庫如下： 5' -TAGACTATCATGTGACTT (N39) GAGTGCTCGATGCTACTAG-3' ；N39 代表 39 個(gè)隨機(jī)核苷 酸。
[0014] 將單鏈DNA文庫擴(kuò)增為雙鏈DNA，產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收純化；以 回收的雙鏈DNA為模板，體外轉(zhuǎn)錄出單鏈RNA隨機(jī)文庫，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物經(jīng)PAGE純化。75 μ g RNA文庫經(jīng)硝酸纖維素膜反篩去除與膜結(jié)合的RNA分子，然后與2ug 1印tin蛋白（利用 CN100366738C公開的方法，表達(dá)得到的目的蛋白），37 ° C孵育30min，反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維 素膜濾過，洗滌濾膜；然后將濾膜剪碎，置于洗脫緩沖液（6mol/L尿素，0. 55mol/L醋酸銨， 1. 5mmol/L EDTA，0· 15% SDS)中煮沸5min，離心，取上清，無水乙醇沉淀RNA，并重新溶解于 20 μ 1 DEPC水中；以RNA為模板RT-PCR擴(kuò)增雙鏈DNA，體外轉(zhuǎn)錄出RNA文庫用于下一輪 篩選；每輪篩選過程中RT-PCR得到雙鏈DNA文庫，以該雙鏈DNA為模板體外轉(zhuǎn)錄出RNA適 配子庫，篩選共進(jìn)行12輪。得到了 15個(gè)適配子，其序列分別為SEQ ID N0:l-15所示。具 體序列如下所示： leptin -1 ： TAGACTATCATGTGACTTCCTTAACTATATACAATTATGTCATATCTTACAAGTACTGAGTGCTCGATGCTAC TAG (SEQ ID NO:1) leptin -2 ： TAGACTATCATGTGACTTTACAAGATACATTCATCCCGCAACACACTCAACCAACTCGAGTGCTCGATGCTAC TAG (SEQ ID NO:2) leptin -3 ： TAGACTATCATGTGACTTTCTACCTAATAATAACCTATACCTCCCTCAGTAATCACAGAGTGCTCGATGCTAC TAG (SEQ ID NO:3) leptin -4 ： TAGACTATCATGTGACTTACCTATTAACTTGTACTCCTACAAACCCAGAACAACACAGAGTGCTCGATGCTAC TAG (SEQ ID N0:4) leptin -5 ： TAGACTATCATGTGACTTTCACTGTTAACACAGATAATTAACATAACAACGTCTATAGAGTGCTCGATGCTAC TAG (SEQ ID NO:5) leptin -6 ： TAGACTATCATGTGACTTAAACATCCTCCCTATACCTATCCGTATACCGCTTCCTCTGAGTGCTCGATGCTAC TAG (SEQ ID NO:6) leptin -7 ： TAGACTATCATGTGACTTAACACCGCCTAATATTAATATCCCCTTCTTCATAGATCAGAGTGCTCGATGCTAC TAG (SEQ ID NO:7) leptin -8 ： TAGACTATCATGTGACTTCCGACTTCATACATACTCCTCTTCATCCTGTAATCAACCGAGTGCTCGATGCTAC TAG (SEQ ID NO:8) leptin -9 ： TAGACTATCATGTGACTTATATATCCTCCACTTAGATAACAATCTTCAGACACTCCAGAGTGCTCGATGCTAC TAG (SEQ ID NO:9) leptin -10 ： TAGACTATCATGTGACTTCCTCCTTCTTCCTCCGATTCATCCTCAATAGATACTATTGAGTGCTCGATGCTAC TAG (SEQ ID NO:10) leptin -11 ： TAGACTATCATGTGACTTTTCACGCTCAATCATAAATCTTAGAATCCAATAATTACCGAGTGCTCGATGCTAC TAG (SEQ ID NO:11) leptin -12 ： TAGACTATCATGTGACTTCCGCCACTCCTCATCACATCGCCACACCCAAATTCACAAGAGTGCTCGATGCTAC TAG (SEQ ID NO:12) leptin -13 ： TAGACTATCATGTGACTTCGCTCCTCTCTTGTTTACTACACATATCTTGTTATCTTAGAGTGCTCGATGCTAC TAG (SEQ ID NO:13) leptin -14 ： TAGACTATCATGTGACTTACCTATTCCGCCCTCACCTTCCTCTACTAGATCATAACTGAGTGCTCGATGCTAC TAG (SEQ ID NO:14) leptin -15 ： TAGACTATCATGTGACTTATAATTCTATATATATCGCACTACATCAAACGCCATAAAGAGTGCTCGATGCTAC TAG (SEQ ID NO:15) 實(shí)施例2蛋白結(jié)合適配子的性能測定 將RNA適配子分別取2. Ομg，用牛小腸堿性磷酸酶（CIP) 37° C消化lh，純化回收 去磷酸化的RNA ;通過T4多核苷酸激酶標(biāo)記[γ -32P]ATP于去磷酸化的RNA分子末端。 lOnmol放射性標(biāo)記的RNA適配子分別與不同濃度（1-200ηΜ)的1印tin 37° C孵育30min， 各組反應(yīng)液經(jīng)硝酸纖維素膜濾過，洗滌濾膜，干燥濾膜，液閃計(jì)數(shù)儀測定濾膜上殘留的放射 量，同一樣品平行做兩次測定。計(jì)算各個(gè)適配子與leptin的解離常數(shù)。結(jié)果如下：
實(shí)施例3所述適配子特異性分析以及穩(wěn)定性分析 分別采用人血白蛋白，免疫血清球蛋白，霍亂弧菌VgrG3C蛋白，大腸桿菌外膜蛋白A， Lp-PLA2蛋白，1印tin，與14條適配子進(jìn)行特異性檢測，經(jīng)過結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，這些適配子都 不與這些蛋白相結(jié)合，而只與leptin結(jié)合保持較高的特異性。
[0015] 將所述的適配子，取0.2ug，分別置于常溫的血清、水溶液中，放置二周。通過 RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)二周的放置其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，沒有被降解。
[0016] 實(shí)施例4所述適配子疾病的診斷 將14個(gè)適配子分別與12個(gè)格雷夫斯眼病患者以及正常人的血液混合30min，通過生 物素分離，定量分析其中的leptin蛋白的含量，通過分析發(fā)現(xiàn)，12個(gè)格雷夫斯眼病患者中 1印tin蛋白的含量相對于正常人顯著增加2倍。
[0017] 以上僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本發(fā)明，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人 員來說，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所做的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本 發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種用于眼科疾病檢測的試劑盒，其含有核酸適體。2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述核酸適體為SEQIDNo:1-15任一項(xiàng) 所述。3. -種檢測眼科疾病的方法，其特征在于利用權(quán)利要求1所述的試劑盒。4. 如權(quán)利要求1-2所述的試劑盒，其特征在于：所述眼科疾病為格雷夫斯眼病。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種包含特異結(jié)合人瘦素蛋白leptin的核酸適體的試劑盒。本發(fā)明提供的核酸適體，與人瘦素蛋白具有較好的親和能力。利用本發(fā)明的核酸適體，可以捕獲溶液中的人瘦素蛋白，將其制備成為相應(yīng)的試劑盒，將用于眼病的篩查。利用本發(fā)明的試劑盒，具有高靈敏、成本低、易制備、易保存的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】G01N33/68
【公開號】CN105334328
【申請?zhí)枴緾N201510723720
【發(fā)明人】李倩
【申請人】李倩
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年11月1日