用于確定神經(jīng)毒素多肽在細胞中的生物活性的工具和方法
【專利說明】用于確定神經(jīng)毒素多肽在細胞中的生物活性的工具和方法
[0001] 本發(fā)明涉及用于直接確定神經(jīng)毒素多肽在細胞中的生物活性的方法，所述方法包 括以下步驟：a)將對神經(jīng)毒素中毒敏感的細胞與神經(jīng)毒素多肽在允許所述神經(jīng)毒素多肽 發(fā)揮其生物活性的條件下孵育一段時間；b)固定所述細胞，并且，任選地，用去垢劑對所述 細胞進行可滲透化處理；c)將所述細胞與特異結(jié)合未切割的和神經(jīng)毒素切割的底物的至 少第一捕獲抗體并且與特異結(jié)合神經(jīng)毒素切割的底物的切割位點的至少第二捕獲抗體在 允許所述捕獲抗體結(jié)合所述底物的條件下接觸；d)將所述細胞與特異結(jié)合所述第一捕獲 抗體的至少第一檢測抗體在允許所述第一檢測抗體結(jié)合所述第一捕獲抗體的條件下接觸， 從而形成第一檢測復(fù)合體，并且與特異結(jié)合所述第二捕獲抗體的至少第二檢測抗體在允許 所述第二檢測抗體結(jié)合所述第二捕獲抗體的條件下接觸，從而形成第二檢測復(fù)合體；e)確 定步驟d)的第一和第二檢測復(fù)合體的量，和f)通過第二檢測復(fù)合體計算所述細胞中由所 述神經(jīng)毒素多肽切割的底物的量，從而確定所述神經(jīng)毒素多肽在所述細胞中的生物活性。 本發(fā)明還提供用于進行本發(fā)明的方法的試劑盒。
[0002] 肉毒梭菌（Clostridiumbotulinum)和破傷風(fēng)梭菌（Clostridiumtetani)分別 產(chǎn)生高度有效的神經(jīng)毒素，即肉毒桿菌毒素（BoNT)和破傷風(fēng)毒素（TeNT)。這些梭菌神經(jīng) 毒素（CNT)特異結(jié)合神經(jīng)元細胞并且破壞神經(jīng)遞質(zhì)釋放。每種毒素被合成為無活性的未 加工的約150kDa單鏈蛋白。轉(zhuǎn)錄后加工包括二硫橋鍵的形成，和通過細菌蛋白酶的有限 蛋白水解（切割）?；钚陨窠?jīng)毒素由兩條鏈組成，約50kDa的N末端輕鏈和約lOOkDa的 重鏈，它們通過二硫鍵連接。CNT結(jié)構(gòu)上和功能上由三個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，即催化輕鏈，包括易 位結(jié)構(gòu)域（N端半）和受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（C端半）的重鏈；參見，例如，Krieglstein1990， Eur.J.Biochem. 188, 39；Krieglstein1991,Eur.J.Biochem. 202,41；Krieglstein1994， J.ProteinChem. 13,49。肉毒桿菌神經(jīng)毒素被合成為分子復(fù)合體，其包含150kDa神經(jīng)毒素 蛋白和相關(guān)非毒性蛋白。復(fù)合體尺寸根據(jù)梭菌菌株和不同的神經(jīng)毒素血清型而不同，范圍 為從300kDa，大于500kDa，和900kDa。這些復(fù)合體中的無毒蛋白穩(wěn)定神經(jīng)毒素并且保護其 免受降解；參見Silberstein2004,PainPractice4,S19-S26。
[0003] 肉毒梭菌分泌七種抗原上不同的血清型，其被指定為肉毒桿菌神經(jīng)毒素（BoNT)A 至G。所有血清型連同破傷風(fēng)梭菌分泌的相關(guān)破傷風(fēng)神經(jīng)毒素（TeNT)是通過切割SNARE蛋 白阻斷突觸胞吐作用的Zn2+-內(nèi)切蛋白酶；參見Couesnon，2006,Microbiology，152, 759〇 CNT引起肉毒中毒和破傷風(fēng)中觀察到的弛緩性肌肉麻痹；參見Fischer2007,PNAS104， 10447〇
[0004] 盡管其具有毒性效應(yīng)，肉毒桿菌毒素復(fù)合體已經(jīng)在大量疾病中被用作治療劑。 1989年肉毒桿菌毒素血清型Α在美國被批準(zhǔn)用于人類使用，用于治療斜視、瞼痙攣和其他 病癥。其作為例如商品名為BOTOX(Allergan，Inc.)或商品名為DYSP0RT/REL0XIN(Ipsen， Ltd)的肉毒桿菌毒素A(BoNT/A)蛋白制劑是可商購的。商品名為XE0MIN(Merz Pharmaceuticals，LLC)的改善的、無復(fù)合體的肉毒桿菌毒素A制劑是可商購的。對于治療 應(yīng)用，將所述制劑直接注射入要治療的肌肉中。在生理PH，所述毒素從蛋白復(fù)合體釋放并且 產(chǎn)生所需要的藥理效果。肉毒桿菌毒素的效果僅是暫時的，這是為什么可能需要重復(fù)施用 肉毒桿菌毒素以維持治療效果的原因。
[0005] 梭菌神經(jīng)毒素弱化自主肌肉強度并且是用于斜視，局部肌張力障礙（focal dystonia)，包括宮頸肌張力障礙（cervicaldystonia)，和良性自發(fā)性瞼痙攣（benign essentialblepharospasm)的有效療法。已經(jīng)進一步證明其減輕偏側(cè)面肌痙攣 (hemifacialspasm)，灶性痙攣狀態(tài)（focalspasticity)，并且此外，在多種適應(yīng)證中有 效，如胃腸病癥、多汗癥和美容皺紋矯正；參見Jost2007，Drugs67,669。
[0006] 在梭菌神經(jīng)毒素的制造過程中，所述神經(jīng)毒素的定性和定量確定以及生物活性神 經(jīng)毒素多肽的質(zhì)量控制特別重要。此外，政府機構(gòu)僅接受簡單、可靠且經(jīng)驗證的肉毒桿菌毒 素活性測定。目前，小鼠LD5。生物測定（一種致死性試驗）仍是藥物制造商分析其制劑效力 的"金標(biāo)準(zhǔn)"；參見Arnon等人（2001)，JAMA285,1059-1070。然而，近年來，已近進行大量 努力去尋找替代性方法以減少對動物試驗的需要和與這種類型的基于動物的測定相關(guān)的 所有缺點、成本和倫理問題。此外，監(jiān)管機構(gòu)使制藥公司參與將三"R"原則應(yīng)用于肉毒桿菌 神經(jīng)毒素的效力測試："減少（Reduce)、改善（Refine)、替代（Replace)";參見Straughan， Altern.Lab.Anim. (2006)，34, 305-313。因此，已經(jīng)開發(fā)了基于細胞的測試系統(tǒng)以提供對 使用活體動物的方法的合理的替代方案。然而，迄今僅有三種細胞測試系統(tǒng)可用于確定神 經(jīng)毒素生物活性，其被證明對神經(jīng)毒素多肽足夠敏感。這些基于細胞的測試系統(tǒng)包括使用 體外分化的分離自嗤齒動物胚胎的原代神經(jīng)元（Pellett等人（2011)，Biochem.Biophys. Res.Commun. 404,388_392)，分化的神經(jīng)元誘導(dǎo)的多能干細胞（Whitemarsh等人（2012)， Toxicol.Sci. 126,426-35)，和SiMa細胞系的亞克隆（TO2010/105234A1)。
[0007] 然而，原代神經(jīng)元的分離需要殺死動物并且費力和費時。此外，使用不同原代神經(jīng) 元的測試系統(tǒng)顯示大的差異。類似地，分化的神經(jīng)元誘導(dǎo)的多能干細胞的產(chǎn)生困難且耗時。 此外，這種細胞的儲存非常成問題。使用腫瘤細胞系的測定常常對BoNT不足夠敏感。此外， 所述腫瘤細胞系需要復(fù)雜的分化方案，這導(dǎo)致使用所述細胞系的測定的大的偏差和/或高 的失敗率。
[0008] 本領(lǐng)域中所述的用于確定梭菌神經(jīng)毒素的生物活性的測定包括蛋白質(zhì)印跡分析， 其中神經(jīng)毒素活性通過細胞裂解物中切割的神經(jīng)毒素底物的量來量化。在其他測定中，梭 菌神經(jīng)毒素的活性通過電化學(xué)發(fā)光（ECL)夾心ELISA測量；參見W0 2009/114748A1。同 樣在此情況中，梭菌神經(jīng)毒素的生物活性通過在自細胞裂解物分離后檢測切割的梭菌神經(jīng) 毒素底物來確定。此外，在兩種測定中，神經(jīng)毒素底物需要濃縮。
[0009] 根據(jù)以上所述，政府機構(gòu)可接受的和/或提供基于動物的測試系統(tǒng)的替代方案的 用于確定神經(jīng)毒素多肽活性的進一步的測試系統(tǒng)是非常需要的。
[0010] 因此，本發(fā)明的技術(shù)問題可以被視為提供符合前述需求的工具和方法。該技術(shù)問 題由在權(quán)利要求和在以下的本文中表征的實施方案解決。
[0011] 在第一方面，本發(fā)明涉及用于直接確定神經(jīng)毒素多肽在細胞中的生物活性的方 法，所述方法包括以下步驟：
[0012] a)將對神經(jīng)毒素中毒敏感的細胞與神經(jīng)毒素多肽在允許所述神經(jīng)毒素多肽發(fā)揮 其生物活性的條件下孵育一段時間；
[0013]b)固定所述細胞并且，任選地，用去垢劑對所述細胞進行可滲透化處理；
[0014]c)將所述細胞與特異結(jié)合未切割的和神經(jīng)毒素切割的底物的至少第一捕獲抗體 并與特異結(jié)合神經(jīng)毒素切割的底物的切割位點的至少第二捕獲抗體在允許所述捕獲抗體 結(jié)合所述底物的條件下接觸；
[0015]d)將所述細胞與特異結(jié)合所述第一捕獲抗體的至少第一檢測抗體在允許所述第 一檢測抗體結(jié)合所述第一捕獲抗體的條件下接觸，從而形成第一檢測復(fù)合體，并且與特異 結(jié)合所述第二捕獲抗體的至少第二檢測抗體在允許所述第二檢測抗體結(jié)合所述第二捕獲 抗體的條件下接觸，從而形成第二檢測復(fù)合體；
[0016]e)確定步驟d)的第一和第二檢測復(fù)合體的量；和
[0017]f)通過所述第二檢測復(fù)合體計算所述細胞中由所述神經(jīng)毒素多肽切割的底物的 量，從而確定所述細胞中所述神經(jīng)毒素多肽的生物活性。
[0018] 本發(fā)明的方法允許直接確定神經(jīng)毒素多肽在細胞中的生物活性。這意味著，不再 如在現(xiàn)有技術(shù)中所述的方法中那樣需要裂解細胞和自細胞裂解物分離或濃縮切割的神經(jīng) 毒素底物。例如，在本領(lǐng)域的基于蛋白質(zhì)印跡分析的測定中，通過在SDS聚丙烯酰胺凝膠 中分離和濃縮各樣品的成分來濃縮神經(jīng)毒素底物。在前所述的本領(lǐng)域中所述的ECL夾心 ELISA中，神經(jīng)毒素底物的濃縮通過使用特異結(jié)合切割的神經(jīng)毒素底物的抗體在添加有細 胞裂解物的微量滴定板上進行。通過所述抗體的結(jié)合從裂解物分離切割的神經(jīng)毒素底物， 這導(dǎo)致所述切割的梭菌神經(jīng)毒素底物的濃縮。相反，在本發(fā)明的方法中，切割的神經(jīng)毒素底 物，如對于SNAP-25所例證的，可以在細胞中直接被檢測。為此，將對神經(jīng)毒素中毒敏感的 細胞（如在本文中其他地方更詳細定義的）與神經(jīng)毒素多肽在允許所述神經(jīng)毒素多肽發(fā)揮 其生物活性的條件下孵育一段時間。在下一步中，例如通過添加固定劑如甲醇、乙醇、丙酮、 甲醛或提及的固定劑的混合物來將所述細胞固定。任選地，可以通過使用如本文其他地方 定義的至少一種去垢劑對所述細胞進行可滲透化處理，所述去垢劑如TritonX-100、Tween 20、皂苷、洋地黃皂苷或正辛基-β-吡喃葡糖苷。所述去垢劑可以被包含在適當(dāng)?shù)木彌_劑 如PBS中。之后，將所述細胞與特異結(jié)合未切割的和神經(jīng)毒素切割的底物的至少第一捕獲 抗體并且與特異結(jié)合神經(jīng)毒素切割的底物的切割位點的至少第二捕獲抗體在允許所述捕 獲抗體結(jié)合所述底物的條件下接觸。在本文中，通過特異結(jié)合存在于未切割的和神經(jīng)毒素 切割的神經(jīng)毒素底物中的適當(dāng)?shù)谋砦唬龅谝徊东@抗體能夠確定所述細胞中神經(jīng)毒素底 物的總的含量或量。例如通過特異結(jié)合神經(jīng)毒素底物中的神經(jīng)毒素切割位點，所述第二捕 獲抗體識別并特異結(jié)合僅存在于切割的神經(jīng)毒素底物中的表位。備選地，可以將所述細胞 與所述第一和第二捕獲抗體的混合物接觸，即在提及的條件下將所述細胞與至少第一捕獲 抗體和至少第二捕獲抗體同時接觸。在下一步中，將所述細胞與特異結(jié)合所述第一捕獲抗 體的至少第一檢測抗體在允許所述第一檢測抗體結(jié)合所述第一捕獲抗體的條件下接觸，從 而形成第一檢測復(fù)合體。在接著的步驟中，將所述細胞與特異結(jié)合所述第二捕獲抗體的至 少第二檢測抗體在允許所述第二檢測抗體結(jié)合所述第二捕獲抗體的條件下接觸，從而形成 第二檢測復(fù)合體。備選地，可以將所述細胞與所述第一和第二檢測抗體的混合物接觸，即在 所述條件下，將所述細胞同時與至少第一檢測抗體和至少第二檢測抗體接觸。備選地，在所 述細胞的可滲透化處理后，可以將其與所述第一和第二捕獲抗體和所述第一和第二檢測抗 體的混合物在所述條件下同時接觸。在下一步中，確定所述第一和第二檢測復(fù)合體的量。最 后，通過所述第二檢測復(fù)合體計算所述細胞中由所述神經(jīng)毒素多肽切割的底物的量。由此， 直接確定所述神經(jīng)毒素多肽在細胞中的生物活性。
[0019] 以下，更詳細地描述本發(fā)明的方法。對于細胞培養(yǎng)，首先將如本文定義的對神經(jīng)毒 素中毒敏感的細胞，如神經(jīng)元細胞、SiMa細胞或iPS-衍生的神經(jīng)元，接種在96孔微量滴定 板上。例如根據(jù)W0 2010/105234中公開的步驟將SiMa細胞分化為神經(jīng)元表型，并且例如 根據(jù)W0 2012/135621中所述的測定將iPS-衍生的神經(jīng)元分化為神經(jīng)元表型。然后，用神 經(jīng)毒素多肽如BoNT/A使細胞中毒達約72小時。在隨后的步驟中，將細胞固定在微量滴定 板上，隨后進行ELISA測定。對于固定細胞，可以在-20°C將例如冰冷的甲醇（_20°C)添加 到所述細胞達20分鐘。
[0020] 對于進行ELISA測定，首先洗滌細胞。作為洗滌緩沖液，可以使用例如在10mMPBS 緩沖液（pH7. 4)中的0. 1%TritonX-100。之后，通過猝滅緩沖液如在10mMPBS(pH7. 4) 中的0. 6%H202將內(nèi)源性蛋白酶猝滅，繼之以另一個洗滌步驟。在接下來的步驟，將微量滴 定板上的自由結(jié)合位點用適當(dāng)?shù)姆忾]緩沖液如例如在10mMPBS緩沖液（pH7.4)中的2% BSA及0. 05%TritonX-100封閉。隨后，通過使用適當(dāng)?shù)娜ス竸毎M行可滲透化處理。 作為可滲透化緩沖液，可以使用例如在10mMPBS緩沖液中的0. 5%TritonX-100。可滲透 化處理使得抗體通過細胞中形成的孔擴散。之后，將細胞用上文所述的洗滌緩沖液洗滌。
[0021] 在下一步中，將可滲透化處理的細胞例如與兩種不同抗體的混合物孵育。所述混 合物包含特異結(jié)合未切割的和神經(jīng)毒素切割的底物的第一捕獲抗體和特異結(jié)合神經(jīng)毒素 切割的底物的切割位點的第二捕獲抗體。所述第一和第二捕獲抗體也可以被相繼適用。例 如，第一捕獲抗體可以特異結(jié)合未切割的和神經(jīng)毒素切割的SNAP-25,由此允許定量細胞中 SNAP-25的總的量或含量。此外，在本文所述的評估后，該第一捕獲抗體可以用于歸一化細 胞中切割的SNAP-25的量。第二捕獲抗體特異結(jié)合神經(jīng)毒素切割的底物的切割位點并且因 此允許確定和檢測切割的神經(jīng)毒素底物，如BoNT/A切割的SNAP-25。
[0022] 在本發(fā)明的方法中，以下對總神經(jīng)毒素底物和神經(jīng)毒素切割的神經(jīng)毒素底物的檢 測可以直接在微量滴定板或細胞培養(yǎng)皿上（即在細胞內(nèi)）進行。有利地，因此，在本發(fā)明的 方法中，不需要如在本領(lǐng)域中所述的方法中那樣制備細胞提取物并且從細胞裂解物分離和 /或濃縮神經(jīng)毒素底物。之后，將細胞洗滌從而去除未結(jié)合各自抗原的過量抗體。在之后的 步驟中，將可滲透化處理的細胞與至少第一檢測抗體和至少第二檢測抗體接觸。所述抗體 可以作為混合物被施用，即同時或相繼適用。第一檢測抗體特異結(jié)合第一捕獲抗體。由此 形成第一檢測復(fù)合體。第一檢測抗體可以針對第一捕獲抗體所來源于的物種。例如，在使 用兔多克隆抗-SNAP-25抗體S9684 (Sigma)作為特異結(jié)合未切割的和BoNT/A切割的底物 SNAP-25的第一捕獲抗體的情況下，可以使用抗-兔堿性磷酸酶綴合的抗體作為第一檢測 抗體。第二檢測抗體特異結(jié)合第二捕獲抗體。由此形成第二檢測復(fù)合體。第二檢測抗體可 以針對第二捕獲抗體所來源于的物種。例如，在本文其他地方所述的本發(fā)明的小鼠單克隆 抗體（mAb) 20-2-5用作特異結(jié)合BoNT/A切割的SNAP-25的第二捕獲抗體的情況下，抗-小 鼠辣根過氧化物酶（HRP)綴合的抗體可以用作第二檢測抗體。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言， 第一檢測抗體和第二檢測抗體被綴合以不同酶從而允許特異檢測本發(fā)明方法中使用的各 個第一和第二捕獲抗體是顯而易見的。例如，如本文其他地方所述的基于HRP的檢測可以 用于BoNT/A切割的SNAP-25并且基于堿性磷酸酶的檢測可以用于總（BoNT/A切割的和未 切割的）SNAP-25。之后，將細胞再次洗滌。在接著的步驟中，將熒光HRP底物加至細胞。作 為HRP底物，可以使用例如AmplexUltraRed(Invitrogen)，其在540nm被激發(fā)并且在600nm 發(fā)射。進行與HRP底物的孵育達足夠辣根過氧化物酶充分轉(zhuǎn)化底物的時間。在與HRP底物 孵育后，例如，可以將AP底物DiFMUP(6, 8-二氟-4-甲基傘形酮磷酸酯（6, 8-difluoro-4-methylumbelliferylphosphate);激發(fā)360nm;發(fā)射450nm)加入至HRP底物并且將細胞與 所述兩種底物的混合物孵育。將與所述AP底物的孵育進行一段時間，所述時間允許堿性磷 酸酶充分轉(zhuǎn)化底物。如本領(lǐng)域已知的，根據(jù)對檢測極限的定義，底物必須以一定的量轉(zhuǎn)化， 所述量足以使測量的信號至少高達空白（blank)的平均值加上三個平均值標(biāo)準(zhǔn)差。檢測極 限可以如文獻中所述確定；參見，例如，Armbruster和Pry，ClinicalBiochem.Rev. 2008， 29(附錄1) :S49-S52。因為堿性磷酸酶的最佳pH在堿性區(qū)域，所以相應(yīng)的底物緩沖液是強 堿性的。如果將堿性磷酸酶底物加至HRP底物，辣根過氧化物酶的反應(yīng)由堿性pH終止，并 且堿性磷酸酶轉(zhuǎn)化DiFMUP。轉(zhuǎn)化的HRP底物不受堿性pH影響。最后，兩種底物的熒光測量 如下：
[0023]AmplexUltraRed:激發(fā) 540nm;發(fā)射 600nm
[0024]DiFMUP:激發(fā) 360nm;發(fā)射 450nm
[0025] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，在本發(fā)明的方法中，僅呈現(xiàn)所用底物的不同的激發(fā)/ 發(fā)射波長的那些熒光底物適于檢測第一和第二捕獲抗體。僅在該情況下，其允許特異檢測 各抗原，即總神經(jīng)毒素底物（如未切割的和神經(jīng)毒素切割的SNAP-25)和切割的神經(jīng)毒素底 物（如神經(jīng)毒素切割的SNAP-25)。由此可能同時量化每個孔或細胞培養(yǎng)皿中神經(jīng)毒素底物 的總含量和切割的神經(jīng)毒素底物的量。據(jù)此，有利地可能使本發(fā)明的方法自動化。如本文 其他地方陳述的，預(yù)期選用于本發(fā)明方法的熒光底物呈現(xiàn)激發(fā)/發(fā)射譜之間的充分位移， 從而允許特異檢測各底物。例如，對于HRP底物Amplex及其衍生物和對于AP底物DiFMUP， 該需求得以實現(xiàn)。而在最佳的情況下，使用的熒光底物的激發(fā)/發(fā)射譜之間不存在重疊，已 經(jīng)證明，所用熒光底物的激發(fā)譜的峰區(qū)域中多至30%的重疊是容許的。
[0026] 如本領(lǐng)域技術(shù)人員進一步承認的，本發(fā)明的方法允許直接檢測和量化細胞中被神 經(jīng)毒素多肽切割的神經(jīng)毒素底物，由此確定所述細胞中所述神經(jīng)毒素多肽的生物活性。有 利地，本發(fā)明的方法不需要制備細胞裂解物或提取物和從細胞裂解物/提取物分離或濃縮 切割的神經(jīng)毒素底物，這對于本領(lǐng)域中已知的方法是必須的。作為其結(jié)果，可以節(jié)省樣品 材料。此外，通過本發(fā)明的方法可以減少樣品制備和樣品數(shù)量，因為樣品中總神經(jīng)毒素底 物的量和切割的神經(jīng)毒素底物的量可以同時確定。在本領(lǐng)域中所述的測定中，必須將樣品 細分以彼此分開地檢測兩種抗原，即總神經(jīng)毒素底物和切割的神經(jīng)毒素底物。本發(fā)明的方 法使得不需要細分樣品。由此，可以避免由細分樣品導(dǎo)致的不均一性并且可以節(jié)省樣品材 料。此外，在本領(lǐng)域中所述測定中，抗原可能被降解，其可能偽造切割的神經(jīng)毒素底物的檢 測。這是因為在本領(lǐng)域中所述的測定中，將細胞與含去垢劑的裂解緩沖液（而其不能使神 經(jīng)毒素多肽或其他內(nèi)源性蛋白酶失活）孵育，導(dǎo)致在較長期的樣品儲存后神經(jīng)毒素底物的 降解。由于在所述測定中需要使用細胞裂解物，因此較強的裂解緩沖液不能用于現(xiàn)有技術(shù) 中所述的ECL夾心ELISA。這是因為上述抗原的聚集可能導(dǎo)致抗原非特異吸附于細胞培養(yǎng) 皿或微量滴定板的塑料表面，其又擾亂適當(dāng)?shù)目贵w對抗原的檢測。因為用于檢測抗原的抗 體也與裂解物接觸，所以抗體也可能聚集。在這種情況下，不再可能有可信且準(zhǔn)確的抗原檢 測。通過使用本領(lǐng)域中所述的用于檢測神經(jīng)毒素活性的生物活性的蛋白質(zhì)印跡測定，本發(fā) 明人已經(jīng)遇到這樣的降解反應(yīng)。在_20°C較長地儲存裂解物后，與新鮮裂解物樣品相比，已 經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由于冷凍期間的降解過程，總SNAP-25的檢測信號強烈減少并且切割的神經(jīng)毒素 底物SNAP-25與未切割的神經(jīng)毒素底物SNAP-25之比改變。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)毒素 底物的降解和/或樣品的不穩(wěn)定性可以通過直接將細胞固定在細胞培養(yǎng)皿上