一種使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測抗SS-B抗體IgG的試劑盒及其制備方法和檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測抗 SS-B抗體IgG的試劑盒及其制備方法和檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗SS-B抗體IgG在干燥綜合征患者中的檢出率為40 % -95%。它們通常與抗SS-A 抗體并存?？筍S-B抗體也可在5%-35%的系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE)患者中發(fā)現(xiàn)，在新生兒 紅斑狼瘡（新生兒狼瘡綜合征）中的陽性率為75% -80%。當(dāng)母親抗SS-A抗體或抗SS-B 抗體為陽性（I-III級(jí)），這些抗體可以經(jīng)過胎盤傳給胎兒，除了引起炎癥反應(yīng)外，還經(jīng)常造 成先天性房-室傳導(dǎo)阻滯。但SLE病人血清一般尚含有多種其他抗體，如Sm抗體和U1RNP 抗體等。除SS和SLE外，SS-A和SS-B抗體在其他疾病以及正常人血清中陽性率很低、抗 體效價(jià)亦低，結(jié)合臨床表現(xiàn)較易鑒別。
[0003] 目前臨床上抗SS-B抗體IgG的檢測有的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法。膜條免 疫法應(yīng)用的是膜條顯色技術(shù)，其特點(diǎn)為固定幾個(gè)項(xiàng)目在同一膜條測定，一般通過手工或者 半自動(dòng)膜條儀進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，最終通過肉眼進(jìn)行定性判定，該技術(shù)靈敏度低，反應(yīng)時(shí)間長， 檢測項(xiàng)目只能固定搭配組合，靈活性差。酶聯(lián)免疫吸附法的靈敏度在膜條免疫法基礎(chǔ)上有 所提升，但仍然較低，并且線性范圍窄，重復(fù)性差，反應(yīng)時(shí)間也較長，仍然不能很好滿足臨床 的應(yīng)用。
[0004] 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析法，較以前的膜條免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法，在檢測靈 敏度、檢測范圍、檢測時(shí)間及自動(dòng)化操作上有了大大提高，且沒有污染，臨床應(yīng)用廣。
[0005] 目前，使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光分析法在抗SS-B抗體IgG免疫分析產(chǎn)品的應(yīng)用仍未 見。
[0006] 中國專利CN103105489A公開了檢測自身免疫性疾病抗體的免疫印跡試劑盒及其 制備方法，涉及一種檢測多種自身免疫性疾病相關(guān)抗體的免疫印跡試劑盒，解決目前尚無 用于多種自身免疫性疾病體檢篩查的免疫印跡產(chǎn)品技術(shù)上的不足：在所述的硝酸纖維素 膜或尼龍膜上含有：分別由 dsDNA、SS-B/RNP、CCP、SSA，SSB, GAD、ICA、IA-2A、TG，AMA-M2 共10種中的至少兩種天然或重組抗原包被而成的兩條以上平行的檢測線，1條高濃度質(zhì)控 帶，1條中濃度質(zhì)控帶及1條低濃度質(zhì)控帶。該專利公開的是一種膜條免疫法，更能說明膜 條免疫法存在的靈敏度較低、線性范圍窄、重復(fù)性差和反應(yīng)時(shí)間長的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明提供一種使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測抗 SS-B抗體IgG的試劑盒，其能夠以較低的成本制備得到，且能夠?qū)崿F(xiàn)抗SS-B抗體IgG準(zhǔn)確 和高精確地定量測定。
[0008] 本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的：一種使用磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測抗 SS-B抗體IgG的試劑盒，所述試劑盒包括：Anti-SS-B IgG校準(zhǔn)品、Anti-SS-B IgG試劑1 號(hào)、Anti-SS-B IgG試劑2號(hào)、Anti-SS-B IgG磁分離試劑、Anti-SS-B IgG質(zhì)控品和清洗 液。
[0009] 所述Anti-SS-B IgG校準(zhǔn)品包括6個(gè)液體校準(zhǔn)瓶，所述液體校準(zhǔn)瓶內(nèi)目標(biāo)濃度分 別為0、5、20、50、100、200RU/mL的抗Anti-SS-B抗體IgG和牛血清白蛋白的Tris緩沖液；
[0010] 所述Anti-SS-B IgG試劑1號(hào)為1個(gè)容積為5mL的含有生物素標(biāo)記的SS-B抗原 和牛血清白蛋白的Tris緩沖液的瓶；
[0011] 所述Anti-SS-B IgG試劑2號(hào)為1個(gè)容積為15mL的含有堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗 人多克隆抗體和牛血清白蛋白的Tris緩沖液的瓶；
[0012] 所述Anti-SS-B IgG磁分離試劑為1個(gè)容積為5mL的含有鏈霉親和素標(biāo)記的磁微 粒和牛血清白蛋白的Tris緩沖液瓶；所述Anti-SS-B IgG質(zhì)控品包括2個(gè)容積為lmL的質(zhì) 控瓶，所述質(zhì)控瓶內(nèi)的濃度的范圍分別為：16-24RU/mL和80-120RU/mL。
[0013] 所述試劑盒檢測原理為將待測樣品、所述Anti-SS-B IgG試劑1號(hào)混合溫育，樣品 中的抗SS-B抗體IgG與SS-B抗原特異性結(jié)合，再加入所述Anti-SS-B IgG磁分離試劑，抗 SS-B抗體IgG與SS-B抗原的免疫復(fù)合物被吸附到磁微粒表面，洗滌去除未結(jié)合的抗體和雜 質(zhì)，加入Anti-SS-B IgG試劑2號(hào)并混合溫育。堿性磷酸酶標(biāo)記（ALP)的羊抗人IgG抗體 與已經(jīng)結(jié)合在磁珠上的抗SS-B抗體IgG特異性結(jié)合。洗滌去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)后加 入化學(xué)發(fā)光底物，ALP催化底物發(fā)光，測定相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度（RLU)。在一定范圍內(nèi)RLU與樣品 中抗SS-B抗體IgG濃度呈正比，通過RLU就可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出待測樣品的抗SS-B 抗體IgG含量。
[0014] 本發(fā)明采取的又一技術(shù)方案是：一種抗SS-B抗體IgG的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光定量檢測 試劑盒的制備方法，所述試劑盒的制備方法包括以下步驟：
[0015] 步驟1.制備所述Anti-SS-B IgG校準(zhǔn)品包括：Anti-SS-B IgG校準(zhǔn)品稀釋液配制 步驟和Anti-SS-B IgG校準(zhǔn)品配制步驟：
[0016] 所述Anti-SS-B IgG校準(zhǔn)品稀釋液的配制步驟包括：
[0017] 加800mL純化水和11. 2g的Tris到容器中，攪拌混合均勻，再加8. 5g的氯化鈉和 2mL的Proclin300,攪拌至完全溶解，將pH值調(diào)為7. 0-7. 5,加40g的牛血清白蛋白到容器 中，攪拌至完全溶解，再將pH值調(diào)為7. 0-7. 5,用純化水定容至1L，使用0.2 μπι濾器過濾， 將獲得的所述校準(zhǔn)品稀釋液保存在2-8°C待用；
[0018] 所述Anti-SS-B IgG校準(zhǔn)品的配制步驟包括：
[0019] 用上述Anti-SS-B IgG校準(zhǔn)品稀釋液將抗SS-B抗體IgG分別配制為0、5、20、50、 100、200RU/mL共6個(gè)濃度點(diǎn)；
[0020] 步驟2.制備所述Anti-SS-B IgG試劑1號(hào)包括：Anti-SS-B IgG試劑1號(hào)稀釋液 配制步驟和Anti-SS-B IgG試劑1號(hào)配制步驟：
[0021] 所述Anti-SS-B IgG試劑1號(hào)稀釋液的配制步驟：
[0022] 加 800mL純化水、12. lg的Tris和5. 8g的NaCl于1L容器中，攪拌至完全溶解， 再加入2mL的Proclin300,攪拌至完全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白，攪拌至完全溶解， 將pH值調(diào)為7. 0-7. 5,用純化水定容至1L，使用0. 2 μ m濾器過濾，將獲得的所述試劑1號(hào) 稀釋液保存在2-8 °C待用；
[0023] 所述Anti-SS-B IgG試劑1號(hào)的配制步驟：
[0024] 用0· 2mol/L的ρΗ9· 0碳酸鹽緩沖液配制0· 5mg/mL的生物素溶液，按照SS-B抗 原與生物素溶液質(zhì)量比為10:1的比例在SS-B抗原溶液中加入到上述0. 5mg/mL的生物 素溶液，混合均勻，室溫靜置18h，反應(yīng)生成SS-B抗原-生物素連接物的反應(yīng)液，將得到的 SS-B抗原-生物素連接物反應(yīng)液通過G-25凝膠柱進(jìn)行分離，除去未反應(yīng)的生物素，得到 SS-B抗原-生物素連接物，再用所述試劑1號(hào)稀釋液將SS-B抗原-生物素連接物稀釋到 0. 1-0. 3 μ g/mL，得到所述的試劑1號(hào)；
[0025] 步驟3.制備所述Anti-SS-B IgG試劑2號(hào)包括：Anti-SS-B IgG試劑2號(hào)稀釋液 配制步驟和Anti-SS-B IgG試劑2號(hào)的配制步驟：
[0026] 所述Anti-SS-B IgG試劑2號(hào)稀釋液的配制步驟：
[0027] 加800mL純化水、6. 06g的4-羥乙基哌嗪乙磺和8. 5g的NaCl到容器中，攪拌至完 全溶解，再加入5g的牛血清白蛋白、0. lg的ZnCl2、0. 2mL的Proclin 300和0. lg的MgCl2， 攪拌至完全溶解，將pH值調(diào)為7. 5-8. 0,用純化水定容至1L，使用0. 2um濾器過濾，將獲得 的所述試劑2號(hào)稀釋液保存在2-8 °C待用；
[0028] 所述Anti-SS-B IgG試劑2號(hào)的配制步驟：
[0029] 將lmg的羊抗人抗體和2-4 μ L的10mg/mL的偶聯(lián)劑為2-亞胺四氫噻吩溶液，室 溫靜置20min，加入0. lmol/L的甘氨酸溶液10 μ L，室溫靜置5min，用G-25凝膠柱除鹽， 收集活化后抗體，將活化后的抗體保存在2-8°C備用，取1. 5mg的堿性磷酸酶，加入5mg/ mL的4-(N-馬來酰亞胺基甲基）環(huán)己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯溶液10-20 μ L，室溫靜置 30min，用G-25凝膠柱除鹽，收集活化后堿性磷酸酶，將活化后的堿性磷酸酶保存在2-8°C 備用，再將上述活化的羊抗人抗體與活化的堿性磷酸酶混合，在2-8°C條件下靜置12-24h， 用Supperdex200凝膠純化柱純化，獲得羊抗人抗體-堿性磷酸酶連接物濃溶液，置于 2_8°C保存?zhèn)溆茫瑢⒀蚩谷丝贵w-堿性磷酸酶連接物濃溶液用所述試劑2號(hào)稀釋液稀釋到 0. 02-0. 1 μ g/mL，得到所述的試劑2號(hào)；
[0030] 步驟4.制備所述Anti-SS-B IgG磁分離試劑包括：Anti-SS-B IgG磁分離試劑稀 釋液配制步驟和Anti-SS-B IgG磁分離試劑配制步驟：
[0031] 所述Anti-SS-B IgG磁分離試劑稀釋液配制步驟：
[0032] 加800mL純化水、12. lg的Tris和8. 5g的NaCl到容器中，攪拌至完全溶解，再加 5g的牛血清白蛋白、50mL的新生牛血清和0. 2mL的Proclin300,攪拌至完全溶解，將pH值 調(diào)為7. 9-8. 1，用純化水定容至1L，使用0. 2 μ m濾器過濾，將獲得的所述磁分離試劑稀釋液 保存在2-8 °C待用；
[0033] 所述Anti-SS-B IgG磁分離試劑配制步驟：
[0034] 取100mg磁微粒，磁分離去上清，取用0· 025mol/L的pH值為4.