克氏原螯蝦眼柄多肽激素的提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種從克氏原螯蝦眼柄組織中提取多肽激素的方法，具體涉及超聲波結(jié)合反相高效液相色譜法提取眼柄多肽激素的方法。本發(fā)明為激素的理化性質(zhì)及功能研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。
【背景技術(shù)】
[0002]蝦蟹類眼柄內(nèi)分泌系統(tǒng)主要由類似于脊椎動物的下丘腦神經(jīng)垂體系統(tǒng)的X-器官竇腺復(fù)合體(X-organ sinus gland complex)組成。X器官位于視端髓的外緣，竇腺位于視內(nèi)髓與視端髓交處的背方，由竇腺壁與中央血竇腔組成，竇腺壁由X-器神經(jīng)分泌細(xì)胞軸突的末梢及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞交織而成。竇腺不具分泌功能，由X-器官神經(jīng)分泌細(xì)胞分泌的激素經(jīng)軸突神經(jīng)束，運(yùn)送至竇腺暫時儲存，后進(jìn)入血液循環(huán)。迄今已從蝦蟹類動物的眼柄中分離純化出六種激素，均為肽類激素，根據(jù)肽鏈的長短和分子量的不同可將其分為兩類，一類為促色素細(xì)胞激素(Chromatophorotropins)，分子量較小，約8_20個氨基酸殘基，包括色素集中激素(Pigment concentrating hormone,PCH)和色素分散激素(Pigment dispersinghormone, PDH);另一類的肽鏈約由70-80個氨基酸殘基組成，包括蛻皮抑制素(Moltinhibiting hormone，MIH)、甲殼動物高血糖激素(Crustacean hyperglycemic hormone,CHH)、性腺抑制激素(Gonad inhibiting hormone，GIH)、大顎器抑制激素(Mandibularorgan inhibiting hormone，Μ0ΙΗ)。
[0003]從蝦蟹類眼柄組織中提取多肽激素的方法很多，如硫酸銨法、超臨界萃取法等，但均存在諸多問題，而不盡人意。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種超聲波結(jié)合反相高效液相色譜法提取克氏原螯蝦眼柄多肽激素的方法。
[0005]—種克氏原螯蝦眼柄多肽激素的提取方法，所述的方法包括以下步驟:
[0006]1.眼柄分離
[0007]選取健康活性好的克氏原螯蝦，不分性別，保持體表清潔，將其眼柄從基部剪斷，在預(yù)冷的含0.7% NaCl的Tris-HCl緩沖液(0.01mol/L，pH 7.4)中解剖出視上神經(jīng)節(jié)(包含竇腺)，在體視顯微鏡下剝離去除結(jié)締組織后置于1.5mL的離心管中，每lmL緩沖液放入50個視上神經(jīng)節(jié)。
[0008]2.超聲波破碎
[0009]將步驟1的緩沖液攪拌均勻，靜置，放置于超聲波細(xì)胞粉碎儀中，超聲波輸出功率為150W-300W，超聲處理溫度45°C _65°C，超聲處理時間為工作5s-間隔5s，循環(huán)30次。將破碎后的勻漿液離心15min (4°C，12000rpm)，取上清液。
[0010]3.受熱粗分離
[0011]將步驟2中上清液在80-85°C下水浴5min，使其中的非耐熱蛋白受熱變性而沉淀下來。所得上清液再次離心，重復(fù)熱水浴兩次。得到的上清液即為河蟹視上神經(jīng)節(jié)內(nèi)多肽激素的粗提液。
[0012]4.反相高效液相色譜
[0013]將步驟3的粗提液經(jīng)過Sep-Pak小柱，收集后合并其餾分作為供試液經(jīng)過反相高效液相色譜柱。色譜條件為:色譜柱L Bondapak C18, ID 4mm*250mm，10 μm ;預(yù)柱為ID4mm*30mm ;柱溫40°C;流動相為乙腈-甲醇-0.6%乙酸(體積比為5:50:45)，0.8mL/min恒流洗脫；收集時間為洗脫開始的2-65min，檢測波長280nm。收集流出組分即為克氏原螯蝦眼柄多肽激素的混合提取物。
[0014]進(jìn)一步的技術(shù)方案在于:步驟2中的超聲波破碎處理時間為工作5s-間隔5s，循環(huán)30次。
[0015]進(jìn)一步的技術(shù)方案在于:步驟2中的超聲波破碎處理溫度為45°C _65°C，無需保持冰浴低溫狀態(tài)。
[0016]進(jìn)一步的技術(shù)方案在于:步驟3中，對上清液80-85°C下水浴5min，重復(fù)兩次，以便沉淀非耐熱性多肽。
[0017]進(jìn)一步的技術(shù)方案在于:步驟4中的洗脫液為酸性環(huán)境的乙腈。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
[0019]1甲殼動物的CHH家族為一類具有酸性等電點(diǎn)的熱穩(wěn)定性神經(jīng)多肽，提取粗提液時采取熱水浴的方法可以有效的去除一部分雜蛋白的干擾，為接下來的層析分離奠定了基礎(chǔ)。
[0020]2粗提液經(jīng)過Sep-Pak小柱可以消除混合液中的鹽離子，保證供試液的最佳酸堿環(huán)境。
[0021]2根據(jù)目的多肽的性質(zhì)，采用酸性環(huán)境、連續(xù)濃度梯度的乙腈作為洗脫液，280nm檢測，通過蛋白液相色譜儀的反相柱對眼柄激素蛋白粗提液進(jìn)行進(jìn)一步的分離，具有明顯的分離效果。
【附圖說明】
[0022]圖1多肽激素提取物的SDS-PAGE電泳
[0023]1為提取的多肽激素混合物2，3為洗脫開始前后流出液Μ為蛋白Marker
【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步闡述。
[0025]實(shí)施例1
[0026]按下述步驟進(jìn)行:選取健康活性好的克氏原螯蝦25只，不分性別，將其眼柄從基部剪斷，在預(yù)冷的含0.7% NaCl的Tris-HCl緩沖液(0.01mol/L，pH 7.4)中解剖出視上神經(jīng)節(jié)(包含竇腺)，在體視顯微鏡下剝離去除結(jié)締組織后置于1.5mL的離心管中，每lmL緩沖液放入50個視上神經(jīng)節(jié)。將緩沖液放置于超聲波細(xì)胞粉碎儀中，超聲波輸出功率為150W-300W，超聲處理溫度50°C，超聲處理時間為工作5s-間隔5s，循環(huán)30次。將破碎后的勾楽液離心15min(4°C，12000rpm)，取上清液在80°C下水浴5min，離心并重復(fù)熱水浴一次。經(jīng)過Sep-Pak小柱，收集后合并其饋分經(jīng)過反相高效液相色譜柱L Bondapak C18，ID4mm*250mm，10 μ m ;預(yù)柱為ID 4mm*30mm ;柱溫40°C;流動相為乙腈-甲醇_0.6%乙酸(體積比為5:50:45)，0.8mL/min恒流洗脫；檢測波長280nm，測吸光度，計(jì)算多肽激素混合物的蛋白濃度。
[0027]在本說明書中所談到的“一個實(shí)施例”，指的是結(jié)合該實(shí)施例描述的具體特征、結(jié)構(gòu)或者特點(diǎn)包括在本申請概括性描述的至少一個實(shí)施例中。進(jìn)一步來說，結(jié)合任一個實(shí)施例描述一個具體特征、結(jié)構(gòu)或者特點(diǎn)時，所要主張的是結(jié)合其他實(shí)施例來實(shí)現(xiàn)這種特征、結(jié)構(gòu)或者特點(diǎn)也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種克氏原螯蝦眼柄多肽激素的提取方法，所述的方法包括以下步驟: (1)眼柄分咼 選取健康活性好的克氏原螯蝦，不分性別，保持體表清潔，將其眼柄從基部剪斷，在預(yù)冷的含0.7% NaCl的Tris-HCl緩沖液(0.01mol/L，pH 7.4)中解剖出視上神經(jīng)節(jié)(包含竇腺)，在體視顯微鏡下剝離去除結(jié)締組織后置于1.5mL的離心管中，每lmL緩沖液放入50個視上神經(jīng)節(jié)。 (2)超聲波破碎 將步驟(1)的緩沖液攪拌均勻，靜置，放置于超聲波細(xì)胞粉碎儀中，超聲波輸出功率為150W-300W，超聲處理溫度45°C _65°C，超聲處理時間為工作5s_間隔5s，循環(huán)30次。將破碎后的勻漿液離心15min (4°C，12000rpm)，取上清液。 (3)受熱粗分離 將步驟(2)中上清液在80°C _85°C下水浴5min，使其中的非耐熱蛋白受熱變性而沉淀下來。所得上清液再次離心，重復(fù)熱水浴兩次。得到的上清液即為河蟹視上神經(jīng)節(jié)內(nèi)多肽激素的粗提液。 (4)反相高效液相色譜 將步驟(3)的粗提液經(jīng)過Sep-Pak小柱，收集后合并其餾分作為供試液經(jīng)過反相高效液相色譜柱。色譜條件為:色譜柱L Bondapak C18，ID 4mm*250mm，10 μm ;預(yù)柱為ID4mm*30mm ;柱溫40°C;流動相為乙腈-甲醇-0.6%乙酸(體積比為5:50:45)，0.8mL/min恒流洗脫；收集時間為洗脫開始的2-65min，檢測波長280nm。收集流出組分即為克氏原螯蝦眼柄多肽激素的混合提取物。2.進(jìn)一步的技術(shù)方案在于:步驟2中的超聲波破碎處理時間為工作5s-間隔5s，循環(huán)30次。3.進(jìn)一步的技術(shù)方案在于:步驟2中的超聲波破碎處理溫度為45°C -65°C，無需保持冰浴低溫狀態(tài)。4.進(jìn)一步的技術(shù)方案在于:步驟3中，對上清液80-85°C下水浴5min，重復(fù)兩次，以便沉淀非耐熱性多肽，此步驟不可省略。5.進(jìn)一步的技術(shù)方案在于:步驟4中的洗脫液為酸性環(huán)境的乙腈。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種克氏原螯蝦眼柄多肽激素的提取方法，所述的方法包括以下步驟：1.眼柄分離將眼柄從基部剪斷，在預(yù)冷的含0.7％NaCl的Tris-HCl緩沖液中解剖出視上神經(jīng)節(jié)(包含竇腺)，每1mL緩沖液放入50個視上神經(jīng)節(jié)。2.超聲波破碎超聲波輸出功率為150-300W，超聲處理溫度45-65℃，超聲處理時間為工作5s-間隔5s，循環(huán)30次。3.受熱粗分離上清液在80-85℃下水浴5min并離心，重復(fù)熱水浴兩次。4.反相高效液相色譜先經(jīng)過Sep-Pak小柱，再經(jīng)過反相高效液相色譜柱，柱溫40℃；流動相為乙腈-甲醇-0.6％乙酸(體積比為5:50:45)，0.8mL/min恒流洗脫；收集時間為洗脫開始的2-65min，檢測波長280nm。本發(fā)明用避免低溫的超聲破碎結(jié)合反相高效液相色譜，提取效率高，純度好，提取的眼柄多肽激素混合液可以用于實(shí)驗(yàn)室功能研究。
【IPC分類】G01N30/06, G01N30/88
【公開號】CN105353055
【申請?zhí)枴緾N201510761171
【發(fā)明人】水燕, 徐增洪, 沈懷舜, 周鑫
【申請人】中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心
【公開日】2016年2月24日
【申請日】2015年11月10日