檢測(cè)狗毛過(guò)敏原特異性IgE抗體的試劑盒及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)療器械生物類免疫體外診斷領(lǐng)域，特別是涉及一種檢測(cè)狗毛過(guò)敏原 特異性IgE抗體的試劑盒及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] IgE抗體介導(dǎo)的I型過(guò)敏反應(yīng)性疾病相當(dāng)普遍，世界各國(guó)變態(tài)反應(yīng)疾病的總發(fā)病 率約為15%_30%，我國(guó)大約有5-10%的人受過(guò)敏原的襲擾，是當(dāng)前世界性的重大衛(wèi)生學(xué)問(wèn) 題，被世界衛(wèi)生組織（WHO)列為二十一世紀(jì)重點(diǎn)防治的三大疾病之一。
[0003] 過(guò)敏性疾病是患者吸入、攝食入或者注入含有致敏成分的物質(zhì)（稱為過(guò)敏原或變 應(yīng)原，Allergen)后觸發(fā)機(jī)體的B細(xì)胞產(chǎn)生特異性免疫球蛋白E(Immunoglobulin E, IgE)， 從而引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)(或稱變態(tài)反應(yīng)，Allergy)的疾病及相關(guān)癥狀，如過(guò)敏性哮喘、枯草熱、蕁 麻疹、過(guò)敏性鼻炎、濕疹、結(jié)膜炎及胃腸道I型過(guò)敏性疾病及嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)等。上述過(guò)敏性 疾病的發(fā)生，IgE抗體起關(guān)鍵作用。
[0004] 動(dòng)物的毛發(fā)中存在有能使人類產(chǎn)生機(jī)體免疫反應(yīng)的過(guò)敏原，引起咳嗽、流涕、打噴 嚏、過(guò)敏性鼻炎、皮疹、哮喘等不同程度的過(guò)敏反應(yīng)。
[0005] 在國(guó)內(nèi)，狗毛（E5)過(guò)敏原特異性IgE抗體檢測(cè)臨床上主要以國(guó)外進(jìn)口試劑和免疫 組化試劑應(yīng)用為主，國(guó)外進(jìn)口試劑價(jià)格非常昂貴，給患者帶來(lái)很大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，不利于在基 層普及。具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的國(guó)產(chǎn)狗毛（E5)過(guò)敏原特異性IgE抗體免疫化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試 劑盒目前還沒(méi)有上市。
[0006] 因此，有待開(kāi)發(fā)對(duì)狗毛（E5)過(guò)敏原特異性IgE抗體檢測(cè)靈敏度高與可靠性并能降 低檢測(cè)成本的檢測(cè)技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明主要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種檢測(cè)狗毛過(guò)敏原特異性IgE抗體的試劑 盒及方法，該試劑盒性能可靠，靈敏度高，線性范圍寬，可配合全自動(dòng)儀器使用，能提高檢測(cè) 靈敏度及可靠性，并降低成本，延長(zhǎng)有效期。
[0008] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的一個(gè)技術(shù)方案是：提供一種檢測(cè)狗毛過(guò)敏原 特異性IgE抗體的試劑盒，包括的試劑有：校準(zhǔn)品、質(zhì)控品、生物素標(biāo)記的狗毛過(guò)敏原溶液、 堿性磷酸酶標(biāo)記的鼠抗人IgE二抗溶液、鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒懸浮液。
[0009] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述生物素標(biāo)記的狗毛過(guò)敏原溶液的濃度為 0. 1~1. 0 ug/ml，所述鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒懸浮液的濃度為0. 1~1. 0 mg/ml，所述 堿性磷酸酶標(biāo)記的鼠抗人IgE二抗溶液的濃度為0. 1~2. 0 ug/ml。
[0010] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述校準(zhǔn)品的濃度為：0 IU/ml、0. 35 IU/ml、0. 7 IU/ml、3.5 IU/ml、17.5 IU/ml、50 IU/ml、100 IU/ml，所述校準(zhǔn)品是 IgE 蛋白與 0·1Μ、ρΗ值 為7. 4的Tris-HCl緩沖液配制得到的；所述質(zhì)控品的濃度為：0. 7 IU/ml、17. 5 IU/ml，所述 質(zhì)控品是IgE蛋白與0. 1M、pH值為7. 4的Tris-HCl緩沖液配制得到的。
[0011] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述狗毛過(guò)敏原為能與人體內(nèi)狗毛特異性IgE蛋白 結(jié)合的抗原，所述生物素標(biāo)記的狗毛過(guò)敏原溶液的制備過(guò)程為：將狗毛過(guò)敏原按1:20摩爾 比加入到溶于二甲基甲酰胺的生物素中，再用0. 1Μ、ρΗ值為7. 4的磷酸鹽緩沖液透析得到。
[0012] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述標(biāo)記的鼠抗人IgE二抗為能與人體內(nèi)IgE蛋 白特異結(jié)合的抗體，所述堿性磷酸酶標(biāo)記的鼠抗人IgE二抗溶液的制備方法為：將濃度為 1. 0-5. Omg/mL的堿性磷酸酶溶液與鼠抗人IgE二抗按摩爾比為2-10 :1進(jìn)行混合后并純 化，得到堿性磷酸酶標(biāo)記的鼠抗人IgE二抗，所述純化是用pH為8-9的碳酸氫鹽緩沖液平 衡并洗脫，再紫外檢測(cè)和記錄純化圖譜，再用〇. 05M、pH值為6. 0的MES緩沖液對(duì)堿性磷酸 酶標(biāo)記的鼠抗人IgE抗體稀釋。
[0013] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒懸浮液的制備過(guò) 程為：將鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒用磁分離器沉淀，再用0. 01M、pH值為7. 4的磷酸鹽 緩沖液重懸，混勻磁分離沉淀，并重復(fù)清洗，清洗后的納米磁微粒分散于〇. 〇1Μ、ρΗ值為7. 4 的磷酸鹽緩沖液。
[0014] 提供一種納米磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)血清狗毛過(guò)敏原特異性IgE抗體的方 法，包括步驟為： (1) 將磁微粒試劑、生物素標(biāo)記的狗毛過(guò)敏原和待檢樣本混勻并反應(yīng)，反應(yīng)后置于磁場(chǎng) 中靜置并去上清，得到第一溶液； (2) 向所述第一溶液中加入堿性磷酸酶標(biāo)記的鼠抗人IgE二抗混勻并反應(yīng)，反應(yīng)后置 于磁場(chǎng)中靜置并去上清，得到第二溶液； (3) 向所述第二溶液中加入發(fā)光底物并反應(yīng)，測(cè)發(fā)光強(qiáng)度； (4) 利用已知濃度的校準(zhǔn)品繪制發(fā)光強(qiáng)度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)步驟（3)得到的發(fā)光強(qiáng)度對(duì)照 所述標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出待測(cè)血清樣本中狗毛特異性IgE的含量。
[0015] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，步驟（1)中所述反應(yīng)的條件為37°C下反應(yīng)15分鐘， 所述靜置的時(shí)間為3分鐘；步驟（1)中還包括對(duì)所述第一溶液用清洗液進(jìn)行清洗，置于磁場(chǎng) 中靜置并去上清，清洗重復(fù)2次；步驟（2)中所述反應(yīng)的條件為37°C下反應(yīng)15分鐘，所述靜 置的時(shí)間為3分鐘；步驟（2)中還包括對(duì)所述第二溶液用清洗液進(jìn)行清洗，置于磁場(chǎng)中靜置 并去上清，清洗重復(fù)2次；步驟（3)中所述反應(yīng)的條件為37°C下反應(yīng)5分鐘，在化學(xué)發(fā)光分 析/測(cè)定儀中測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。
[0016] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述方法在全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀Lumiray系列上進(jìn) 行，所述 Lumiray 系列為 Lumiray 1200、Lumiray 1220、Lumiray 1260 或 Lumiray 1280。
[0017] 在本發(fā)明一個(gè)較佳實(shí)施例中，所述方法包括步驟為： (1) 將所述試劑盒放入全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀的試劑倉(cāng)里并進(jìn)行識(shí)別； (2) 將校準(zhǔn)品置于所述全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光儀的儀器樣本倉(cāng)，識(shí)別校準(zhǔn)品信息，分配校準(zhǔn)品 位置； (3) 將質(zhì)控物或待測(cè)樣本置于儀器樣本倉(cāng)，編輯檢測(cè)信息； (4) 啟動(dòng)運(yùn)行程序，所有校準(zhǔn)品/質(zhì)控物/待測(cè)樣本自動(dòng)進(jìn)行處理得到結(jié)果。
[0018] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明的檢測(cè)狗毛過(guò)敏原特異性IgE抗體的試劑盒及方 法，試劑盒中各試劑組分穩(wěn)定性良好，有效期可至一年以上，檢測(cè)靈敏度高、特異性能好、變 異小，經(jīng)過(guò)大量實(shí)驗(yàn)的工藝優(yōu)化，得到完善統(tǒng)一工藝，并嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)生產(chǎn)操作規(guī)程和質(zhì)量 控制規(guī)程進(jìn)行生產(chǎn)，用戶僅需按照操作說(shuō)明進(jìn)行規(guī)范操作，就可得到可靠的結(jié)果，在臨床研 究中與國(guó)外進(jìn)口試劑的符合相關(guān)性高達(dá)90%以上，且費(fèi)用僅為其1/2。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使 用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹，顯而易見(jiàn)地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它 的附圖，其中： 圖1是本發(fā)明的實(shí)施例一中檢測(cè)狗毛（E5)過(guò)敏原特異性IgE抗體的試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲 線圖； 圖2是本發(fā)明的狗毛（E5)過(guò)敏原特異性IgE抗體檢測(cè)試劑盒與進(jìn)口試劑的性能對(duì)比 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面將對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施 例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通 技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其它實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范 圍。
[0021] 實(shí)施例一： 提供一種基于納米磁微粒全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)狗毛（E5)過(guò)敏原特異性IgE抗 體的試劑盒，包括如下試劑： (1) 生物素標(biāo)記的狗毛過(guò)敏原溶液，濃度為0. 1-1. 0 ug/mL ; (2) 鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒懸浮液，濃度為0. 1-1. 0 mg/mL ; (3) 堿性磷酸酶標(biāo)記的鼠抗人IgE二抗溶液，濃度為0. 1-2. 0 ug/mL ; (4) 6個(gè)不同濃度水平的校準(zhǔn)品：0 11]/1111，0.35 11]/1111，0.7 11]/1111，3.5 11]/1111，17.5 IU/ml,50 IU/ml,100 IU/ml ； (5) 2個(gè)不同濃度水平的質(zhì)控品：0. 7 IU/ml，17. 5 IU/ml。
[0022] 實(shí)施例二： 本發(fā)明提供的一種納米磁微粒全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光法定量檢測(cè)血清中狗毛過(guò)敏原特異性 IgE抗體試劑盒的制備包括如下步驟： (1)配制緩沖液： 配制(λ 01M、pH值為L(zhǎng) 4的磷酸鹽緩沖液，(λ 1Μ、ρΗ值為L(zhǎng) 4的Tris-HCl緩沖液，(λ 05M、 pH值為6. 0的MES緩沖液。
[0023] 0· 01M、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液的配制：取容量1L的燒杯，加入800ml去離子 水，稱取2. 56g Na2HP04*12H20、0. 44g NaH2P04*2H20和9g NaCl，加入到燒杯中，攪拌使其充 分溶解，用HC1或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 4 ±0. 05,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的甘露醇、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1%的甘油，攪拌0. 5h至完全溶解，加去離子水定容至1L。
[0024] 0· 1M、pH值為7. 4的Tris-HCl緩沖液的配制：取容量1L的燒杯，加入800ml去 離子水，稱取12. llg Tris (三羥甲基氨基甲烷）加入到燒杯中，攪拌使其充分溶解，用HC1 或NaOH調(diào)節(jié)pH值至7. 4±0. 05,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的BSA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 3%的Proclin 300,攪拌0. 5h至完全溶解，加去離子水定容至1L。
[0025] 0· 05M、pH值為6. 0的MES緩沖液的配制：取容量1L的燒杯，加入800ml去離子水， 稱取9. 76g MES(2-(N-嗎啉代）乙磺酸)、9g NaCl加入到燒杯中，攪拌使其充分溶液，用HC1 或NaOH調(diào)節(jié)pH值至6. 0±0. 05,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的BSA、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0. 1%的Tween-20， 攪拌0. 5h至完全溶解，加去離子水定容至1L。
[0026] (2)制備生物素標(biāo)記的狗毛過(guò)敏原溶液 將狗毛過(guò)敏原以1:20的比例加入到溶于二甲基甲酰胺的生物素中，室溫條件下充分 混合反應(yīng)30分鐘，反應(yīng)后的溶液用0. 1M、pH值為7. 4的磷酸鹽緩沖液透析。BCA法測(cè)定生 物素標(biāo)記的狗毛過(guò)敏原溶液的濃度，并調(diào)整其濃度到0. 1-1. 0 ug/ml。
[0027] (3)制備鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒懸浮液 將鏈霉親和素標(biāo)記的納米磁微粒用磁分離器沉淀出來(lái)，用〇. 〇1Μ、ρΗ值為7. 4的磷酸鹽 緩沖液重懸，充分混勻15分鐘后磁分離沉出，棄去上清，再用0. 01M、pH值為7. 4的磷酸鹽 緩沖液重懸，如此重復(fù)清洗5次，清洗后的納米磁微粒分散于0. 01M、pH值為7. 4的磷酸