一種食品中草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸殘留量的測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測方法，尤其是一種食品中草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸殘留 量的測定方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 草甘膦（glyphosate，GLY)，化學名稱N-(膦酰基甲基）氨基乙酸，是目前世界上 應(yīng)用最廣、生產(chǎn)量最大的廣譜非選擇性除草劑，但其不合理的使用仍會導致其過高地殘留 于植物體中。草甘膦及其主要代謝物氨甲基膦酸（aminomethylphosphonicacid，AMPA)具 有與有機磷化合物相似的作用毒理，主要通過抑制膽堿脂酶的活性而導致神經(jīng)系統(tǒng)機能失 調(diào)，由草甘膦引起的水體污染植被破壞、牲畜中毒等案件也逐年增加。
[0003] 我國《食品安全國家標準食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB2763-2014)于2014年 8月1日起開始施行，其明確規(guī)定：草甘膦是谷物、油料和油脂、糖料、水果、茶葉等的農(nóng)藥殘 留強檢（必檢）項目，其在這些產(chǎn)品中的殘留限量在0.05-5毫克每千克之間。與中國主要 貿(mào)易國/地區(qū)對食品中草甘膦的殘留限量要求為中國lmg/kg，中國香港lmg/kg，美國lmg/ kg，日本lmg/kg。
[0004]由于草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸均為強極性化合物，不溶于大部分有機溶劑， 既沒有紫外吸收，又不易揮發(fā)，因此，用氣相色譜或高效液相色譜檢測往往需要借助于柱前 或柱后衍生化，其步驟繁瑣，重復性差，質(zhì)控難；或者采用離子色譜法，但在分離GLY時由于 其保留很強，其分離必須采用強淋洗劑碳酸鈉，而其它常見陰離子保留較弱無法對GLY和 其它陰離子進行同時分析，且僅限于對水等較為單一的基體的測試。
[0005] 發(fā)明專利CN101646348B公開了一種測試基質(zhì)中草甘膦、N-乙酰草甘膦、N-乙酰 AMPA或氨甲基磷酸（AMPA)和它的各種代謝物的存在或含量的方法，其凈化采用離子交換 固相萃取柱，很多樣品如香蕉、檸檬、茶末等會堵塞固相萃取柱造成沒法操作，而且回收率 非常低小于5%，需要用昂貴的內(nèi)標物來校正回收。發(fā)明專利CN103529148B公開了一種 食品中除草劑草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸殘留量的檢測方法，主要由提取、吸附、淋洗、 洗脫、定性定量分析五個步驟組成，其以鎂鋁二元水滑石吸附提取液中殘留的草甘膦和氨 甲基膦酸，然后分別以水和甲醇淋洗鎂鋁二元水滑石，還需要以碳酸鈉溶液對吸附在水滑 石中的草甘膦和氨甲基膦酸進行解吸，操作麻煩。基于上述方法都有其局限性，建立一種快 速、簡捷檢測食品中草甘膦及其代謝物的方法是十分必要的。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明所要解決的問題是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種食品中草甘膦及其 代謝物氨甲基磷酸殘留量的測定方法。
[0007] 具體方案如下：
[0008] -種食品中草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸殘留量的測定方法，包括以下步驟：（1) 制備標準工作溶液：以水作溶劑，分別配置成草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸的標準工作溶 液；（2)制備食品樣品試液：(a)稱取樣品試樣，質(zhì)量為m，加水于高速均質(zhì)器上離心均質(zhì)，收 集水相或者上層液相，用水定容至體積為v;(b)取上述步驟（a)中定容的試液，加入透析袋 內(nèi)，置于玻璃管中，加入超純水超聲，取出透析出的殘液，注入二乙烯基苯固相萃取小柱內(nèi)， 棄去二乙烯基苯固相萃取小柱前流出液，收集后流出液；(c)向收集的后流出液中加入石 墨化碳黑，作為吸附劑去除樣品提取溶液中水溶性色素干擾，旋窩震蕩后離心，取上清液， 氮吹至干，殘渣用水溶液溶解，過聚四氟乙烯膜，得到食品樣品試液，備用；(3)采用高效液 相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，對步驟（1)的標準工作溶液分別進行液相色譜-串 聯(lián)質(zhì)譜測定：以標準工作溶液中草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸的濃度X為橫坐標，以對應(yīng) 的測得的定量離子峰面積y為縱坐標，繪制標準工作溶液回歸曲線y=ax+b，計算出回歸曲 線的斜率a和截距b; (4)采用高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀，對步驟（2)的 食品樣品試液進行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，根據(jù)（3)中所獲得的線性方程y=ax+b推算 出食品樣品試液中草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸的濃度c。，進而計算食品樣品中草甘膦及 其代謝物氨甲基磷酸的殘留量c，c=cQXv/m。
[0009] 其進一步的技術(shù)方案是，所述的高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀的 色譜柱為NH2P-50 2D柱。其進一步的技術(shù)方案是，所述的吸附劑石墨化碳黑添加量為 12-32mg，粒徑40-60μm，ProElut填料。其進一步的技術(shù)方案是，所述的高效液相色譜-串 聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀的色譜柱流動相pH為10-11。其進一步的技術(shù)方案是，所述的高 效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀的流動相含有乙酸銨水。其進一步的技術(shù)方案 是，所述的高效液相色譜-串聯(lián)三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用儀的流動相為乙酸銨水和乙腈的混合 溶液。其進一步的技術(shù)方案是，所述的乙酸銨水的濃度為5mmol/L。其進一步的技術(shù)方案 是，所述的食品包括谷物、油料和油脂、糖料、水果和茶葉。
[0010]由于草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸溶于水但是不溶于大部分的有機溶劑，本方法 比較了多種有機溶劑和水對草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸的提取效果，甲醇：水（1:1)、乙 腈：水（1:1)、純甲醇、純乙腈，純水，發(fā)現(xiàn)乙腈和甲醇溶解大量樣品中的有機雜質(zhì)，干擾很 大，且回收率低于30%，最后確定水作為提取劑。本發(fā)明為了降低基質(zhì)效應(yīng)，需對樣品盡可 能凈化。本方法比較了分散固相萃取法、MAX小柱、氨基小柱、HLB小柱、MCX、MAX串聯(lián)柱及 透析袋+二乙烯基苯固相萃取小柱連用的凈化方法，結(jié)果如圖1所示。
[0011] 從圖1中可以看出，分散固相萃取法對兩者基本上沒有回收率，其原因是加入的PSA對草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸具有吸附效果。氨基小柱和HLB小柱對兩者的回收率 也較低，不超過50 %;而只用一根MAX小柱時，草甘膦回收率超過50 %而氨甲基磷酸卻基本 上沒有回收，原因是凈化效果不佳，樣品產(chǎn)生了很強的基質(zhì)抑制，使兩種物質(zhì)的響應(yīng)偏低； 而MCX、MAX串聯(lián)柱子的方法對草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸的回收率均在60%以上，凈化 效果一般，但是食品基質(zhì)例如香蕉、檸檬、茶末等過SPE柱易造成柱子堵塞，提取液通過串 聯(lián)固相萃取小柱基本不可能；而透析袋與二乙烯基苯固相萃取小柱連用的方法回收率均超 過80%。因此本方法選擇透析袋與二乙烯基苯固相萃取小柱的方法對樣品進行凈化。其中， 透析袋的作用在于取出樣品提取溶液中大分子雜質(zhì)干擾物，二乙烯基苯固相萃取小柱是為 了去除提取溶液中疏水性化合物干擾。
[0012] 值得一提的是，發(fā)明專利CN200880010069凈化樣品采用離子交換固相萃取柱，很 多樣品例如香蕉、檸檬、茶末等會堵塞固相萃取柱造成沒法操作，而且回收率非常低小于 5%，需要用昂貴的內(nèi)標物來校正回收。本發(fā)明采用透析膜加二乙烯基苯固相萃取小柱進行 凈化，不會堵塞，且回收率80%以上，不需要使用昂貴的內(nèi)標物來校正回收。
[0013] 石墨化碳黑作為吸附劑，可以很好的去除樣品提取溶液中水溶性色素的干擾，其 添加量為12_32mg，粒徑40-60μπι，采用ProElut填料的效果較好。
[0014] 由于草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸的強極性和水溶性，極難在普通反相色譜柱上 保留，因此本發(fā)明比較了兩種可對草甘膦及其代謝物氨甲基磷酸親水分離色譜柱：HILIC 色譜柱（兩性離子色譜柱）和氨基色譜柱柱進行分離，其中HILIC親水色譜柱是一種可以 保留和分離極性-離子化合物的色譜柱，一些中極性-離子型化合物在有機相比例高時不 保留，而極性弱或者無極性的化合物則不被保留。因此，HILIC柱只能在有機相較低的前提 條件下解決極性-離子型化合物的保留問題，而反反相色譜柱同時具有反相色譜機理和正 相色譜機理，在這種情況下，只要改變流動相就可以在反相色譜與正相水平間進行轉(zhuǎn)換，可 以不需要從流動相中完全去除水就可以進行正相色譜操作；使用100%水相洗脫也不會產(chǎn) 生柱子崩塌；一分鐘之內(nèi)就可以完成梯度洗脫的再平衡。這些優(yōu)點是與HILIC柱子相比較 而言的，水分子會在HILIC固定相表面形成水膜，而在反反相固定相表面，由于其強疏水性 而不會形成水膜。因此，對反反相柱而言不需要像HILIC柱一樣要用水進行清洗。
[0015] 鑒于反反相色譜柱的這些優(yōu)點，采用NH2P-50 2D柱，對比了不同流動相對色譜的 分離和靈敏度。首先對比了不同PH的流動相對色譜分離的影響，結(jié)果表明，pH= 10-11流 動相對草甘膦及其代謝物的效果最好；其次對比了氨水和乙酸銨水對色譜分離的影響，結(jié) 果表明，乙酸銨水的色譜峰型更加符合色譜分析的要求；最后，對比了不同濃度乙酸銨水對 色譜分離的影響，結(jié)果表明，隨著乙酸銨濃度的增加草甘膦及其代謝物的保留增強，但超過 5mmol/L后呈下降趨勢，因此采用流動相為A5mmol/L乙酸銨水，B乙腈，流動相梯度洗脫程 序見表1。液質(zhì)聯(lián)用儀建立測定方法，具有良好的響應(yīng)和峰形。
[0016] 有益效果：（1)本發(fā)明的方法可以準確測定出食品中草甘膦及其代謝物氨甲基磷 酸殘留量，定量準確可靠，且重現(xiàn)性良好；(2)采用透析袋加二乙烯基苯固相萃取小柱進 行凈化，不會堵塞，且回收率80%以上，也不需要使用昂貴的內(nèi)標物來校正回收；（3)采用 NH2P-50 2D柱，以5mmol/L的乙酸銨水和乙腈作為流動相，具有良好的響應(yīng)和峰形。
【附圖說明】