一組結節(jié)病血清特異性標志蛋白及其檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬生物技術和醫(yī)學檢驗領域，涉及用于識別結節(jié)病的檢測標志物及其檢測 試劑盒。尤其涉及一組結節(jié)病血清特異性標志蛋白及其檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 臨床研究顯示，結節(jié)病病因不明，以非干酪性上皮樣肉芽腫為病理特征，全身各個 器官幾乎均可受累，其中最為常見的受累器官是肺臟和胸內(nèi)淋巴結。由于結節(jié)病臨床表現(xiàn) 多樣且缺乏特異性，其確診主要依靠排他性診斷，需要除外許多其他肉芽腫性疾病，其中 最為困難的是結節(jié)病與菌陰結核病的鑒別診斷，尤其在中國這樣的結核病高發(fā)國家顯得 更為突出。目前對于兩者的鑒別診斷多集中在尋找結核桿菌的證據(jù)方面，而且多側重于 結核病的標志物的研究。有研究報道，結節(jié)病血清標志物有血清可溶性白細胞介素受體 2(sIL-2R)，血清血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（SACE)和II型肺泡細胞表面抗原6(KL-6)等，但實踐 證實，這些標志物的敏感性和特異性并不理想，并且對于結節(jié)病和結核病的鑒別診斷方面 未見后續(xù)報道。還有研究通過實時定量PCR方法檢測結節(jié)病和結核病病理組織中結核分 枝桿菌DNA，從病理組織角度建立結節(jié)病和菌陰結核病的鑒別診斷方法；以及通過建立臨 床-影像-病理綜合評分系統(tǒng)用于二者的鑒別診斷，所述方法可以用于解決部分結節(jié)病與 菌陰結核病的鑒別難題，但仍然存在假陽性和假陰性的問題，并且所述方法必須以取得病 理活檢為應用前提，而病理活檢的方式及病理醫(yī)師診斷經(jīng)驗常會對診斷的正確率產(chǎn)生很大 的影響；
[0003] 本申請的的發(fā)明人之前的研究中用結節(jié)病患者血清標本篩選出血清淀粉樣物質(zhì) A(SAA)作為診斷標志物，其診斷結節(jié)病特異度僅為52. 5%，作為單一的指標用于結節(jié)病的 診斷明顯不足。
[0004] 因此，尋找一種更為特異、敏感、簡便、可靠的用于上述兩種疾病的鑒別診斷的檢 測試劑及其檢測試劑盒已成為本領域研究人員較為關注的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種用于識別結節(jié)病的檢測標志物及 其檢測試劑盒。
[0006] 本發(fā)明中，所述的檢測試劑含有一組或一組以上的相關結節(jié)病與結核病的血清學 差異蛋白，本發(fā)明的實施例中篩選相關結節(jié)病與結核病的血清學差異蛋白瘦素（leptin) 及細胞間粘附分子1 (ICAM-1)。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供含有上述檢測試劑的檢測試劑盒。
[0008] 所述的檢測試劑盒包含固相和上述相關結節(jié)病與結核病的血清學差異蛋白，本發(fā) 明的實施例中優(yōu)選血清學差異蛋白1印tin及ICAM-1。
[0009] 本發(fā)明的另一目的是提供上述相關結節(jié)病與結核病的血清學差異蛋白1印tin及 ICAM-1在制備用于鑒別診斷結節(jié)病的檢測試劑中的用途。
[0010] 本發(fā)明通過下述技術方案實現(xiàn)：
[0011] 利用蛋白芯片技術，將篩選出的差異蛋白用酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA)以及免疫 組化（IHC)的方法驗證后，篩選其中的相關結節(jié)病與結核病的血清學差異蛋白，本發(fā)明的 實施例中優(yōu)選血清學差異蛋白1印tin及ICAM-1 ;進一步的進行所述的差異蛋白的血清濃 度數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析處理以及平行試驗與序列實驗的靈敏度及特異度分析處理，確定相關 結節(jié)病與結核病的血清學差異蛋白，尤其是差異蛋白1印tin及ICAM-1聯(lián)合用于檢測結節(jié) 病與結核病的血清濃度，為鑒別結節(jié)病和菌陰結核病提供便捷的特異度及靈敏度高的檢測 試劑以及檢測試劑盒。
[0012] 本發(fā)明中，還提供了采用所述的檢測試劑以及檢測試劑盒對于結節(jié)病以及菌陰結 核病進行檢測的方法及其模型。
[0013] 本發(fā)明通過檢測血清中差異表達的蛋白，聯(lián)合采用統(tǒng)計學的方法分析處理，在不 需取得活檢組織的情況下，僅僅通過檢測患者的血清蛋白，既能在一定程度上獲得兩種疾 病的血清蛋白之間的差別后，基于受試者工作特征曲線（ROCcurve)對制備的診斷試劑及 其試劑盒的檢測效力進行評價。
[0014] 本發(fā)明中將上述的相關結節(jié)病與結核病的血清學差異蛋白，尤其是差異蛋白 leptin及ICAM-1運用R0C曲線、邏輯回歸（logisticregression)及平行序列實驗分析等 統(tǒng)計學方法建立一組鑒別模型，對所述的差異蛋白的血清濃度數(shù)據(jù)以及平行試驗與序列實 驗的靈敏度及特異度分析處理，確定相關結節(jié)病與結核病的血清學差異蛋白表達的差異， 尤其是差異蛋白leptin及ICAM-1聯(lián)合或單獨使用的差異，分析結果有利于鑒別診斷參考。
[0015] 本發(fā)明中，采用所述的檢測試劑盒通過下述步驟對結節(jié)病以及菌陰結核病進行檢 測：
[0016] 1)包被
[0017] 取所要包被的商品化leptin和ICAM-1抗體，設計所需濃度，根據(jù)各包被孔數(shù)計算 所需包被物的量，用包被液稀釋至所需體積，分加至各孔中：
[0018] 包被條件：ELISA板直接置4°C過夜；或先置37°C孵育2小時再轉(zhuǎn)入4°C過夜；
[0019] 2 洗滌
[0020] 包被結束后棄掉包被液，用PBST進行洗滌，方法為PBST加滿每孔，靜置5-10min， 棄掉洗液，重新加滿，重復洗滌3-5次，最后拍干ELISA板等待下一步封閉；
[0021] 3 封閉
[0022] 常用10%小牛血清，取步驟2的ELISA板加封閉液至每孔，體積至少為所加包被液 的兩倍；封閉條件：置于4°C過夜，或置于37°C溫育2-4h;
[0023] 4 洗滌
[0024] 封閉結束的ELISA板進行洗滌，方法同步驟2,排干ELISA板；
[0025] 5加入待檢樣品（血清）
[0026] 按實驗所需稀釋倍數(shù)用包被液稀釋進行稀釋，至所需濃度后加入相應孔中，反應 條件為37°C孵育2h;
[0027] 6 洗滌
[0028] 具體同步驟4;
[0029] 7加相應HRP-標記的商品化二抗
[0030]加相應的商品化HRP-標記的二抗（如一抗為鼠源物質(zhì)則對應加抗鼠二抗），一般 也用封閉液稀釋，稀釋倍數(shù)參考二抗說明書；將稀釋好的二抗加入各孔，37°C反應1-1. 5h;
[0031] 8再洗滌
[0032] 具體同步驟4;
[0033] 9 顯色
[0034] 用商品化TMB顯色液作為底物，顯色液分加至ELISA各孔中；然后將ELISA板置于 37°C反應約lOmin;
[0035] 10 終止：
[0036] 取出ELISA板，每孔加終止液（2mol/L硫酸溶液）終止反應，立即到酶標儀上讀數(shù) (波長為450nm)，根據(jù)cutoff值判斷對結節(jié)病鑒別效力程度。
[0037] 本發(fā)明的一個實施例中，ICAM-1 的cutoff值為 57740pg/ml，Leptin的cutoff值 為 1193. 186pg/ml。
[0038] 本發(fā)明實驗研究結果表明，通過蛋白芯片技術發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白，經(jīng)ELISA及免 疫組化鑒定的1印tin及ICAM-1兩種因子經(jīng)過統(tǒng)計學模型的建立，為兩者的鑒別診斷提供 有意義的輔助。該模型并不僅限于所述的差異蛋白1印tin及ICAM-1，還可以用于驗證存在 差異表達的所有可能的差異蛋白，分別分析不同聯(lián)合組合的鑒別效力。
[0039] 本發(fā)明的優(yōu)點在于：
[0040] 本發(fā)明進行了免疫組化實驗，驗證了所述的差異蛋白Leptin、ICAM-1在結節(jié)病肺 組織及縱膈淋巴結中表達陽性率明顯高于結核病組，兩者表達有明顯差異；并進行了兩種 差異蛋白-細胞因子的血清濃度數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學分析處理以及平行試驗與序列實驗的靈敏 度及特異度分析處理，結果顯示，所述的相關結節(jié)病與結核病的血清學差異蛋白，尤其是差 異蛋白1印tin及ICAM-1聯(lián)合用于檢測結節(jié)病與結核病的血清后，特異度為73. 1%，敏感度 為 86. 5%。
【附圖說明】
[0041] 圖1為單因素方差分析及事后比較檢驗（PostHocTests)分析組間差異因子，
[0042] 其中顯示，結節(jié)病分別與結核病和健康對照組間Leptin、ICAM-1差異均有顯 著意義；結核病與健康組間兩種因子均無統(tǒng)計學差異（P> 〇. 05);血小板衍生生長因子 BB(H)GF-BB)在三組間均無差異。
[0043] 圖2為免疫組化驗證活檢組織中差異蛋白的表達，
[0044] 其中顯示，Leptin在結節(jié)病肺組織中呈強陽性表達，彌漫性分布在肉芽腫及周圍， 而結核病肺組織中肉芽腫為非特異性染色；Leptin在結節(jié)病淋巴結肉芽腫中央較濃聚，表 達呈強陽性，而其在結核病淋巴結肉芽腫中央有弱陽性表達，兩者表達有明顯差異。
[0045] 圖3為免疫組化驗證活檢組織中差異蛋白的表達，
[0046] 其中顯示，ICAM-1在結節(jié)病肺組織及淋巴結中強陽性表達，呈彌漫性和簇狀分布， 結核病肺組織中肉芽腫周圍為非特異性染色或者弱陽性表達。
[0047] 圖4為R0C曲線模型，
[0048]其中分別顯示了BMI、1印tin、ICAM-l三者單獨檢測結節(jié)病和結核的R0C曲線與運 用logstic回歸聯(lián)合形成聯(lián)合因子檢測結節(jié)病和結核病的R0C曲線。
【具體實施方式】
[0049] 實施例1
[0050] 1)蛋白芯片血清差異蛋白分析
[0051] 收集結節(jié)病以及健康獻血者的外周血血清各3例，首先用蛋白芯片技術 (RayBiotechHumanCytokineAntibodyArrayGSeries1000)初篩比較 3 例結節(jié)病患 者及3例健康人血清中120種重要的炎癥細胞因子水平，根據(jù)結果及文獻報道定制了包括 30種重要分子的蛋白芯片（RayBiotechQAH-⑶ST);運用生物芯片系統(tǒng)分析所述細胞因子 在結節(jié)?。?0例）及對照組（結核病組20例、正常對照組20例）外周血血清中的含量；
[0052] 所用試劑盒為廣州RayBiotech公司定制的抗體芯片，掃描儀為美國Axon公司 Genepix熒光掃描儀；實驗步驟按其說明書進行，采用Genepix熒光掃描儀Cy3通道掃描信 號，QAH-CUST-G數(shù)據(jù)分析軟件進行數(shù)據(jù)分析；
[0053] 蛋白芯片血清差異蛋白分析結果如表1所示，篩選出結節(jié)病與結核病組之間3個 差異蛋白分別為 ICAM-1，L印tin，PDGF-BB，P < 0· 05。
[0054] 表1蛋白芯片篩選結果
[0055]
[005υ」

[0057] *a、SA結節(jié)病，TB結核病，HC健康對照
[0058] *b、p < 0· 05, /表示未檢測到濃度。
[0059] 2)用ELISA驗證蛋白芯片初篩出血清中的差異蛋白
[0060] 將蛋白芯片的初篩結果擴大樣本量運用ELISA驗證，ICAM-1、L印tin、TOGF-BB ELISA試劑盒購自上海欣奧盛公司（NeobioscienceTechnologyCompanyLimited),實驗 所用酶標儀為BioTekInstruments公司ELX808,操作步驟按試劑盒說明書進行；在450nm 波長下測定吸光度值，計算各樣品濃度；
[0061] 相關分析結果顯示，leptin在血清中含量與BMI成正相關（p< 0· 0001)，r= 0.549 (Pearson相關系數(shù)），顯示兩者顯著相關；回歸分析顯示BMI與1印tin含量存在直 線回歸關系（P< 〇. 001)，即1印tin隨著BMI的增加而升高；這與1印tin表達與體重有關 的報道一致，為了排除體重對1印tin的影響，以BMI為協(xié)變量，做結節(jié)病組與結核病組對 leptin血清濃度影響的協(xié)方差分析，經(jīng)校正后的結節(jié)病和結核病組leptin血清濃度