一種基于色差對(duì)比的土霉素檢測(cè)試紙、使用方法及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境分析領(lǐng)域，涉及一種基于色差對(duì)比的土霉素檢測(cè)試紙的制備與應(yīng) 用。 技術(shù)背景
[0002] 土霉素（Oxytetracycline)是一種廣譜抗菌劑，是目前使用最廣泛的四環(huán)素類抗 生素，因具有廣譜抗菌、價(jià)格低廉的特點(diǎn)，常被用做畜禽藥物以及飼料添加劑。然而，土霉素 不能被人體或其他動(dòng)物的代謝作用完全分解，會(huì)通過迀移轉(zhuǎn)化進(jìn)入自然環(huán)境中，影響生態(tài) 環(huán)境穩(wěn)定，導(dǎo)致抗藥細(xì)菌的出現(xiàn)，對(duì)人類的健康和環(huán)境造成威脅。
[0003] 目前對(duì)于抗生素檢測(cè)的傳統(tǒng)方法包括高效液相色譜法（HPLC)、酶聯(lián)免疫法 (ELISA)、毛細(xì)管電泳（CE)、表面增強(qiáng)拉曼光譜法（SERS)等。但上述方法存在設(shè)備昂貴，操 作復(fù)雜耗時(shí)，需要專業(yè)人員等不足之處，故多用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，難以實(shí)現(xiàn)商品化。
[0004] 目前在市場(chǎng)上已經(jīng)出現(xiàn)了一些基于酶聯(lián)免疫法原理的抗生素快速檢測(cè)產(chǎn)品，如 ELISA試劑盒和膠體金快速檢測(cè)卡，其檢測(cè)原理都是通過標(biāo)記抗體與抗原免疫反應(yīng)來檢測(cè) 目標(biāo)物。該方法的問題在于作為識(shí)別元件的抗體需要通過生物方法培養(yǎng)獲得，制備過程復(fù) 雜且在自然環(huán)境中容易受到影響，保存難度較大，在與酶或膠體金結(jié)合的過程中易失活，這 會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品靈敏度下降，甚至出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象，影響檢測(cè)結(jié)果。
[0005] 核酸適配子是一段人工合成的核酸序列，可以特異性結(jié)合靶標(biāo)物質(zhì)。相比于抗體， 核酸序列可以通過體外合成獲得，易于保存且穩(wěn)定性更好，故利用適配子作為識(shí)別原件對(duì) 土霉素進(jìn)行檢測(cè)具有實(shí)際應(yīng)用方面上的優(yōu)勢(shì)，但目前市場(chǎng)上并未出現(xiàn)基于核酸適配子檢測(cè) 土霉素的試紙類產(chǎn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種以核酸適配子為識(shí)別元件，基于色差對(duì)比的土霉素快 速檢測(cè)試紙。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案：
[0008] -種基于色差對(duì)比的土霉素檢測(cè)試紙，包括結(jié)合區(qū)、顯色區(qū)和吸水區(qū)，依次排布， 結(jié)合區(qū)、顯色區(qū)和吸水區(qū)的面積比為2:1:4~3:1:9,以聚氯乙烯（PVC)膠板為底襯；試紙 一端的結(jié)合區(qū)粘貼含有濃度為1~1〇〇μΜ的土霉素適配子的玻璃纖維素膜，試紙中間的 顯色區(qū)粘貼含有石墨烯/納米鉑的硝酸纖維素膜，試紙另一端的吸水區(qū)粘貼吸水紙，中間 顯色區(qū)的硝酸纖維素膜分別與其兩端的結(jié)合區(qū)的玻璃纖維素膜和吸水區(qū)的吸水紙間有重 置；
[0009]與該土霉素檢測(cè)試紙匹配的顯色液為濃度0.2~20mM的3, 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯 胺（TMB)溶液與過氧化氫溶液的混合液，且混合液pH值為2~6 ;
[0010] 土霉素適配子序列：
[0011] 5 '-CGTACGGAATTCGCTAGCCGAGTTGAGCCGGGCGCGGTACGGGTACTGGTATGTGTGGGGATCCGA GCTCCACGTG-3'。
[0012] -種基于色差對(duì)比的土霉素檢測(cè)試紙的使用方法為：取兩條相同規(guī)格的試紙，將 試紙結(jié)合區(qū)分別插入標(biāo)準(zhǔn)水樣（已知濃度的土霉素水樣）與待測(cè)水樣（未知的濃度土霉素 水樣）中，待水樣完全浸潤(rùn)顯色區(qū)，上升至吸水區(qū)時(shí)，取出試紙靜置1~2min;再將試紙插 入顯色液中，靜置2~3min，對(duì)比兩條試紙顏色變化情況；土霉素檢測(cè)試紙的判別標(biāo)準(zhǔn)：若 兩條試紙顯色區(qū)顏色相同，則判定待測(cè)水樣中土霉素含量未超標(biāo)；若兩條試紙顯色區(qū)顏色 不同，且待測(cè)水樣組顯色區(qū)顏色較標(biāo)準(zhǔn)水樣組顏色深，則判定待測(cè)水樣中土霉素含量超標(biāo)。
[0013] -種基于色差對(duì)比的土霉素檢測(cè)試紙的制備方法，步驟如下：
[0014] (1)制備氧化石墨烯；
[0015] (2)制備石墨烯/納米鉑溶液：向濃度為0. 5mg/mL的石墨烯氧化物水溶液加入濃 度為10mM的氯鉑酸和濃度為20mM的谷氨酸，石墨烯氧化物水溶液、氯鉑酸和谷氨酸的體積 比為20:6:1~30:15:1 ;將上述混合液稀釋6~10倍，調(diào)節(jié)pH值至10~12 ;將混合液超 聲2~5h后，在180°C下水熱反應(yīng)8~16h;
[0016] (3)將硝酸纖維素膜浸入步驟（2)制備得到的石墨烯/納米鉑溶液中，浸漬石墨烯 /納米鉑溶液的硝酸纖維素膜作為顯色區(qū)；
[0017] (4)在玻璃纖維素膜中央滴加濃度為1~100μΜ的土霉素適配子溶液作為結(jié)合 區(qū)；
[0018] (5)以PVC膠板為底襯，將結(jié)合區(qū)、顯色區(qū)和吸水區(qū)按順序粘貼在底襯上，中間 顯色區(qū)的硝酸纖維素膜分別與其兩端的結(jié)合區(qū)的玻璃纖維素膜和吸水區(qū)的吸水紙間有重 置；
[0019] (6)將濃度為0· 2~20mM的ΤΜΒ(3, 3'，5, 5' -四甲基聯(lián)苯胺）溶液與過氧化氫溶 液混合，作為與土霉素檢測(cè)試紙配套的顯色液，該顯色液pH值為2~6。
[0020] 石墨烯/納米鉑具有類過氧化氫酶的特性，可以有效催化過氧化氫酶底物TMB與 過氧化氫反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的顏色變化（由無色變?yōu)闇\藍(lán)再到深藍(lán)，一段時(shí)間后繼續(xù)反應(yīng)至 綠色，最終變?yōu)辄S色）。土霉素適配子（單鏈DNA)可以通過π-π作用力吸附在石墨烯氧 化物表面，與石墨烯/納米鉑形成復(fù)合結(jié)構(gòu)，阻礙過氧化氫酶底物分子在石墨烯/納米鉑復(fù) 合催化劑界面的擴(kuò)散和結(jié)合，抑制催化反應(yīng)的有效進(jìn)行。當(dāng)體系中存在靶物質(zhì)（土霉素） 時(shí)，適配子會(huì)首先與靶物質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物，減弱與復(fù)合催化劑之間結(jié)合的作用力，從而減 弱對(duì)于復(fù)合催化劑催化能力的抑制作用。
[0021] 通過以上理論，可以將靶物質(zhì)（土霉素）的量轉(zhuǎn)化為復(fù)合催化劑石墨烯/納米鉑 的催化能力，并通過顯色劑（ΤΜΒ/Η202)的顏色體現(xiàn)出來。在本發(fā)明中，可通過標(biāo)準(zhǔn)水樣與待 測(cè)水樣對(duì)于試紙顯色區(qū)顯色情況的不同進(jìn)行判別，從而判斷待測(cè)水樣中土霉素含量是否超 標(biāo)。
[0022] 本發(fā)明的有益效果：
[0023] (1)操作簡(jiǎn)單，效果直觀，檢測(cè)速度快，不需要大型儀器設(shè)備，3~5min即可完成對(duì) 水樣中土霉素的檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。
[0024] (2)選擇性高，抗干擾能力強(qiáng)。本發(fā)明試紙采用土霉素適配子作為識(shí)別原件，避免 了膠體金試紙所面臨的抗體易失活問題。采用色差對(duì)比模式進(jìn)行判別，動(dòng)態(tài)比較，避免了因 試紙上藥品性能降低而導(dǎo)致的假陽性現(xiàn)象。
[0025] (3)靈敏度高，0·5mg/L~5mg/L的土霉素溶液均具有檢出效果。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明檢測(cè)試紙的主視結(jié)構(gòu)示意圖。
[0027] 圖2為本發(fā)明檢測(cè)試紙的側(cè)視結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 本發(fā)明的土霉素檢測(cè)試紙的一個(gè)實(shí)施例：
[0029] (1)氧化石墨烯的制備：
[0030] 石墨稀氧化物采用改進(jìn)的Hmnmers化學(xué)法制備。具體步驟如下：稱取1. 0g石墨粉 緩慢加入到25mL濃硫酸中，充分?jǐn)嚢韬?，? °C冰水浴中緩慢加入3gKMn04，緩慢加入同時(shí) 充分?jǐn)嚢?，然后連續(xù)超聲12h后，得到深褐色溶液，然后緩慢加入46mL去離子水，加熱煮沸 15min后，再依次加入140mL高純水和10mL雙氧水終止反應(yīng)，得到亮黃色的石墨烯氧化物水 溶液。3000r/min離心分離后，用5%的稀鹽酸10000r/min離心洗滌2次去除雜質(zhì)，然后用 高純水10000r/min離心洗滌5次去除稀鹽酸。洗滌后取出純化的石墨氧化物，最后40°C真 空干燥得到固體石墨烯氧化物。
[0031] (2)石墨烯/納米鉑的制備：
[0032] 取2. 5mL配置好的0.5mg/mL的石墨稀氧化物水溶液于燒杯中，加入lmL配制好的 10mM氯鉑酸，再加入100μL20mM的谷氨酸，用高純水稀釋到25mL同時(shí)用NaOH溶液調(diào)節(jié)至 pH=11。將混合液置于超聲清洗器中超聲3h后取出。將該溶液加入聚四氟乙烯水熱反應(yīng) 釜中，放入電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中在180°C下水熱反應(yīng)12h。
[0033] (3)試紙顯色區(qū)的制備
[0034] 將硝酸纖維素膜裁剪成7_X7mm尺寸大小，浸入稀釋20倍后的步驟（2)中制備 的石墨烯/納米鉑溶液中，完全浸透后抽真空干燥待用。
[0035] (4)試紙結(jié)合區(qū)的制備
[0036] 將玻璃纖維素膜裁剪成15mmX7mm尺寸大小，在每塊玻璃纖維素膜的中央滴加 5μΜ濃度的土霉素適配子溶液10μL，真空干燥待用。
[0037] (5)試紙吸水區(qū)的制備
[0038] 將吸水紙裁剪成40mmX7mm尺寸大小待用。
[0039] (6)試紙的組裝
[0040] 將帶有粘性底襯的PVC膠板裁剪成600mmX7mm尺寸大小，在膠板上的一端粘貼步 驟（4)中制備的結(jié)合區(qū)，在膠板的中間粘貼步驟（3)中制備的顯色區(qū)，在膠板的另一端粘貼 步驟（5)中制備的吸水區(qū)。其中結(jié)合區(qū)與吸水區(qū)分別與顯色區(qū)交疊l_X7mm面積的區(qū)域。
[0041] (7)顯色液的制備
[0042]取150μL濃度為2. 9mM的TMB(3, 3'，5, 5'-四甲基聯(lián)苯胺）溶液（pH=4)與 0. 5yL30%的過氧化氫混合，加入到2mL的離心管中，密封待用。
[0043] (8)檢測(cè)過程
[0044] 取兩條相同規(guī)格的試紙1和2,將試紙結(jié)合區(qū)部分分別插入水樣1 (超純水）與水 樣2 (5mg/L土霉素溶液）中，待水樣完全浸潤(rùn)顯色區(qū)，上升至吸水區(qū)時(shí)，取出試紙靜置2min。 然后將試紙插入顯色液之中，靜置3min，對(duì)比兩條試紙顏色變化情況。
[0045] (9)檢測(cè)結(jié)果
[0046] 試紙1與試紙2呈現(xiàn)明顯可見的顏色差異：試紙2呈現(xiàn)深藍(lán)色，試紙1呈現(xiàn)淺藍(lán) 色。故判定水樣2中土霉素含量超標(biāo)。
[0047] 本發(fā)明的土霉素檢測(cè)試紙的另一個(gè)實(shí)施例：
[0048] (1)氧化石墨烯的制備：
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