紅豆杉枝條中紫杉醇含量的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測方法，具體是一種紅豆杉枝條中紫杉醇含量的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紅豆杉，又稱紫杉，是世界上瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物，屬國家一級保護植 物，既有高大的喬木，又有低矮的灌木，全世界大約有幾十種。是集觀賞和藥用于一身的珍 貴樹種，從植株中提取的紫杉醇是世界公認的抗癌藥，價格昂貴。因而，紅豆杉也具有"植物 黃金"之稱。
[0003] 由于紫杉醇的特性化學(xué)結(jié)構(gòu)，目前已經(jīng)工業(yè)化生產(chǎn)的紫杉醇原料藥主要是從紅豆 杉中天然提取的或者通過從紅豆杉中提取10-DABIII，而后采用半合成的方式來制備的。 《中國藥典》對紫杉醇原料藥的檢測方法已經(jīng)有標(biāo)準(zhǔn)，但是對紅豆杉枝條中紫杉醇含量的檢 測卻沒有標(biāo)準(zhǔn)，傳統(tǒng)的檢測方法過于復(fù)雜，不適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)中紅豆杉原料篩選過 程中的檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是針對上述現(xiàn)狀，提供一種簡單、快速、準(zhǔn)確、精密度好的紅豆杉枝 條中紫杉醇的含量檢測方法。
[0005] -種紅豆杉枝條中紫杉醇含量的檢測方法，其包括以下步驟：
[0006] S11 :供試品溶液的制備：新鮮紅豆杉枝條凈洗、干燥、粉碎至60~80目，精密稱 取紅豆杉枝條粉末2.00g，置于離心管中，粉末經(jīng)脫脂、提取、液液萃取步驟，濃縮物用甲醇 溶解定容，混合均勻，溶液用〇.45μm濾膜過濾，濾液作為供試品溶液；
[0007] S12 :對照品溶液的制備：精密稱取紫杉醇對照品10mg置10mL容量瓶中，加入甲 醇溶解并定容至l〇mL，混合均勻后，用移液槍精密量取lmL置100mL容量瓶中，加入甲醇至 刻度線，搖勻即得濃度為l〇mg/L對照品溶液，-20°C儲藏備用；
[0008] S13 :高效液相色譜法測定：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μL，注 入液相色譜儀，記錄圖譜，分別計算供試品溶液中紫杉醇的峰面積和對照品溶液中紫杉醇 的峰面積；色譜條件：用C18柱作為色譜柱，以甲醇-乙腈-水、乙腈-水或甲醇-水混合溶 液為流動相，檢測波長為227nm，流速為1. 00mL/min，柱溫30°C，理論塔板數(shù)不低于3000 ;
[0009] S14 :紫杉醇濃度計算：C紫杉醇=(C對照品XA供試品）/A對照品；其中：A對照 品為對照品溶液中紫杉醇的峰面積；A供試品為供試品溶液中紫杉醇的峰面積；C對照品為 對照品溶液中紫杉醇的濃度；C紫杉醇為供試品溶液中紫杉醇的濃度。
[0010] 本發(fā)明采用高效液相色譜法檢測紅豆杉枝葉中紫杉醇的含量，通過檢測方法學(xué)研 究，優(yōu)化了處理方法、色譜條件，表明本含量檢測方法具有操作簡單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好等特 點，能夠較好的檢測紅豆杉枝葉中紫杉醇的含量。
【附圖說明】
[0011] 圖1所示為本發(fā)明實施方式提供的紅豆杉枝條中紫杉醇含量的檢測方法的流程 圖。
[0012] 圖2所示為流動相為甲醇-水（60 : 40)條件下紫杉醇對照品溶液和紅豆杉枝條 樣品溶液對比圖。
[0013] 圖3所示為流動相為甲醇-乙腈-水（25 : 35 : 40)條件下紫杉醇對照品溶液 和紅豆杉枝條樣品溶液對比圖。
[0014] 圖4所示為流動相條件為乙腈-水（55 : 45)條件下紫杉醇對照品溶液和紅豆杉 枝條樣品溶液對比圖。
[0015] 圖5所示為紫杉醇對照品溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線。
【具體實施方式】
[0016] 以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限 定本發(fā)明的范圍。
[0017] 如圖1-5所示，為本發(fā)明實施方式提供的一種紅豆杉枝條中紫杉醇含量的檢測方 法，其包括以下步驟：
[0018] S11 :供試品溶液的制備：新鮮紅豆杉枝條凈洗、干燥、粉碎至60~80目，精密稱 取紅豆杉枝條粉末2. 00g，置于離心管中，粉末經(jīng)脫脂、提取、液液萃取步驟，濃縮物用甲醇 溶解定容，混合均勻，溶液用0. 45μm濾膜過濾，濾液作為供試品溶液；
[0019] S12 :對照品溶液的制備：精密稱取紫杉醇對照品10mg置10mL容量瓶中，加入甲 醇溶解并定容至l〇mL，混合均勻后，用移液槍精密量取lmL置100mL容量瓶中，加入甲醇至 刻度線，搖勻即得濃度為l〇mg/L對照品溶液，-20°C儲藏備用；
[0020] S13 :高效液相色譜法測定：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20μL，注 入液相色譜儀，記錄圖譜，分別計算供試品溶液中紫杉醇的峰面積和對照品溶液中紫杉醇 的峰面積；色譜條件：用C18柱作為色譜柱，以甲醇-乙腈-水、乙腈-水或甲醇-水混合溶 液為流動相，檢測波長為227nm，流速為1. 00mL/min，柱溫30°C，理論塔板數(shù)不低于3000 ;
[0021] S14 :紫杉醇濃度計算：C紫杉醇=(C對照品XA供試品）/A對照品；其中：A對照 品為對照品溶液中紫杉醇的峰面積；A供試品為供試品溶液中紫杉醇的峰面積；C對照品為 對照品溶液中紫杉醇的濃度；C紫杉醇為供試品溶液中紫杉醇的濃度。
[0022] 本實施方式中，步驟S11中所述脫脂溶劑為石油醚，溶劑體積為30mL，重復(fù)2次。
[0023] 本實施方式中，步驟S11中所述提取溶劑為甲醇、乙醇、丙酮。優(yōu)選所述提取溶劑 為甲醇。
[0024] 本實施方式中，步驟S11中所述提取為浸提或超聲提取。優(yōu)選所述提取為超聲提 取，提取條件為：時間60min，功率250W、頻率100kHz。
[0025] 本實施方式中，步驟S11中所述的液液萃取為二氯甲烷-水（1 : 1)，水相用二氯 甲烷萃取三次。具體操作步驟為：將合并后的甲醇提取液，于50°C水浴減壓濃縮蒸干，濃縮 物用60mL體積比為1 : 1的二氯甲烷-水溶液復(fù)溶，取二氯甲烷層，水相再加入30mL二氯 甲烷萃取兩次，合并三次的二氯甲烷相；二氯甲烷溶液減壓濃縮蒸干，濃縮物用甲醇溶解， 并定容至100mL。
[0026] 本實施方式中，步驟S13中所述C18色譜柱為TR-C18-X液相色譜柱，優(yōu)選 4. 6X250mmX5μπι的TR-C18-X液相色譜柱。
[0027] 本實施方式中，步驟S13中所述流動相為體積比為25:35:40的甲醇-乙 腈-7義、體積比為55:45的乙腈-水或體積比為60:40的甲醇-水。
[0028] 試驗例
[0029] 1、儀器與試劑信息：
[0030]AgilentllOO型高效液相色譜儀（美國Agilent公司），萬分之一天平（常州市天 之平儀器設(shè)備有限公司），miiner超純水機，電熱鼓風(fēng)干燥箱（武漢金寶華科技有限公司）， 超聲波清洗機（深圳市精鉆誠超聲波設(shè)備有限公司），5-5N低速離心機（湖南恒諾儀器設(shè) 備有限公司），GZY科研及粉碎機（上海高致精密儀器有限公司）。
[0031] 紫杉醇對照品（批號，北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司），色譜級甲醇，色譜級乙 腈，分析級甲醇，分析級乙醇，分析級丙酮，分析級石油醚，水為實驗室自制超純水。
[0032] 2、方法與結(jié)果
[0033] 2. 1液相色譜條件的選擇
[0034] 2. 1.1流動相的選擇
[0035] 流動相的選擇中，對甲醇-乙腈-水（25 : 35 : 40)、乙腈-水（55 : 45)、甲 醇-水(60 : 40)等不同流動相進行了篩選，結(jié)果表明以甲醇-水(60 : 40)溶液作為流 動相所得色譜圖的分離度、對稱性較好，所以選用甲醇-水(60 : 40)溶液作為流動相。
[0036]2. 1. 2測定波長的選擇
[0037] 取濃度為50mg/L的對照品溶液用紫外分光光度計測試，測定紫杉醇在波長227~ 228nm處有最大吸收，該結(jié)果與文獻中報道的結(jié)果一致，所以選用227nm為測定波長。
[0038] 綜合多方面的原因，確定本發(fā)明的最優(yōu)色譜條件為：
[0039]色譜柱：4. 6X250mmX5μπι的TR-C18-X;流動相：甲醇-水（60 : 40)溶液；波 長：227nm;柱溫：30°C;流速：1. 00mL/min。
[0040] 2. 2供試品處理方法的選擇
[0041] 2. 2. 1供試品提取溶劑的選擇
[0042] 精密稱取紅豆杉枝條粉末2.00g三份，置于離心管中，加入石油醚30mL，超聲脫脂 2次，每次30min，脫脂后的殘渣50°C烘干；干燥后的殘渣分別加入30mL甲醇、乙醇、丙酮， 超聲提取，每次60min，共提取3次，合并提取液，其中乙醇和丙酮溶液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥后 加入甲醇復(fù)溶，甲醇溶液離心后置于l〇〇mL容量瓶中，用甲醇加至刻度，混合均勻，溶液用 0.45μm濾膜過濾即得。測定紫杉醇的含量結(jié)果，結(jié)果見表1
[0043] 表1不同提取溶劑提取效果比較
[0044]
[0045] 結(jié)果表明，甲醇的提取效果好，故選用甲醇作為提取溶劑。
[0046] 2. 2. 2樣品提取方法的選擇