一種elisa試劑盒抗原間接包被酶標(biāo)板的包被方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種酶標(biāo)板的包被方法，具體涉及一種ELISA試劑盒抗原間接包被酶 標(biāo)板的包被方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 抗原間接包被是指首先用某抗原的特異性抗體（單抗或多抗）包被酶標(biāo)板，然后 再通過抗原抗體的特異性結(jié)合，捕獲目標(biāo)抗原于酶標(biāo)板上，用于組裝ELISA試劑盒?？乖g 接包被制備酶標(biāo)板的好處在于：一是有助于促進(jìn)基因工程方法表達(dá)的目標(biāo)抗原蛋白形成其 自然構(gòu)象，通過抗原抗體的特異性親合反應(yīng)，進(jìn)一步純化了包被抗原，經(jīng)過洗滌過程使蛋白 結(jié)構(gòu)更接近自然構(gòu)象，從而提高診斷方法的敏感性與特異性；二是經(jīng)過半純化和復(fù)性的目 標(biāo)抗原蛋白就可以滿足要求。
[0003]目前，國產(chǎn)ELISA試劑盒質(zhì)量不穩(wěn)定，主要原因在于直接或間接抗原包被酶標(biāo)板 的穩(wěn)定性差，導(dǎo)致ELISA試劑盒保存期短；并且市場上的抗原穩(wěn)定劑，不僅價格昂貴，而且 來源不穩(wěn)定，嚴(yán)重影響了我國ELISA類診斷試劑盒的研制。因此，抗原包被酶標(biāo)板的包被工 藝是保證ELISA試劑盒質(zhì)量的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種穩(wěn)定性好，保存期長、成本低的ELISA試 劑盒抗原間接包被酶標(biāo)板的包被方法。
[0005] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題采用的技術(shù)方案是，一種ELISA試劑盒抗原間接包被酶標(biāo) 板的包被方法，包括以下步驟：
[0006] (1)包被：用0· 05mol/L pH 9. 6碳酸鹽緩沖液稀釋單克隆抗體或多克隆抗體至工 作濃度1~2 μ g/mL，加入酶標(biāo)板，每孔加95~105 μ L，室溫下（18~25°C )包被過夜，然 后用PBS洗3次；
[0007] (2)封閉：每孔加含10g/L魚明膠的0· 01mol/L PBS緩沖液95~105 yL，35~ 38°C封閉1~2h，然后用PBS洗滌3次；
[0008] (3)捕獲目標(biāo)抗原：用0· Olmol/L PBS緩沖液稀釋目標(biāo)抗原至工作濃度0· 5~ 1. 5 μ g/mL，每孔95~105 μ L加入酶標(biāo)板，18~25°C捕獲反應(yīng)1~1. 5h，然后用PBS洗滌 3次；
[0009] (4)加固相抗原穩(wěn)定劑：在酶標(biāo)板孔濕潤的狀況下，每孔加入120~150μL固相 抗原穩(wěn)定劑，室溫作用20~40min，棄殘液；酶標(biāo)板置于室溫、濕度20%~30%的潔凈空 間，抽濕機(jī)抽干10~12小時，即得抗原間接包被酶標(biāo)板；其中，所述固相抗原穩(wěn)定劑為含 5%蔗糖和1~5%牛血清白蛋白的0. 01m〇l/L，pH 7. 0~7. 6磷酸鹽緩沖液。
[0010] 進(jìn)一步，步驟（1)中，所述單克隆抗體為口蹄疫病毒3A單克隆抗體，工作濃度為 2 μ g/mL ;所述多克隆抗體為口蹄疫病毒2C多克隆抗體，工作濃度為1 μ g/mL。
[0011] 進(jìn)一步，步驟（4)中，所述固相抗原穩(wěn)定劑為含5%鹿糖和1%牛血清白蛋白的 0.0 lmol/L，pH 7. 5的磷酸鹽緩沖液，加入0. 1%硫柳汞防腐劑，37°C放置4周制成。
[0012] 本發(fā)明之ELISA試劑盒抗原間接包被酶標(biāo)板的包被方法可使間接抗原包被酶標(biāo) 板的保存期達(dá)到1年以上，顯著提高了 ELISA試劑盒的穩(wěn)定性與保存期；而且所用抗原穩(wěn)定 劑的配方簡單，對抗原抗體反應(yīng)沒有干擾，材料易于獲得、來源不受限制，適用范圍廣。
【具體實施方式】
[0013] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)一步加以說明。
[0014] 1、材料與方法
[0015] (1)材料：碳酸鹽緩沖液（Na2C03/NaHC0 3)及明膠購自SIGMA公司；口蹄疫病毒 非結(jié)構(gòu)蛋白3A與3B單克隆抗體為本實驗室制備保存采用常規(guī)方法制備；辣根過氧化物 酶（HRP)標(biāo)記3B單克隆抗體委托南京金斯瑞公司標(biāo)記，滴定工作濃度為1 : 5000 ; 口蹄 疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C表位區(qū)多克隆抗體由本實驗室采用常規(guī)方法制備，采用表達(dá)的2C表 位區(qū)蛋白免疫家兔制備；口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC參考以下文獻(xiàn)表達(dá)：曹軼梅，劉在 新，盧曾軍，等.口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因3ABC在大腸桿菌中的表達(dá)[J].畜牧獸醫(yī) 學(xué)報，2004, 35(1) :115-118;口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白2C3AB表達(dá)參考以下文獻(xiàn)進(jìn)行：張小 麗，田美娜，盧曾軍，等.FMDV非結(jié)構(gòu)蛋白2C主要表位區(qū)與3AB基因的組合表達(dá)與活性 分析·生物工程學(xué)報，2009, 25 (1) : 10-15 [J]。
[0016] (2)非結(jié)構(gòu)蛋白3ABC與2C3AB融合蛋白的表達(dá)、純化及復(fù)性參考以下文獻(xiàn)進(jìn)行：
[0017] 曹軼梅，劉在新，盧曾軍，等.口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白基因3ABC在大腸桿菌中 的表達(dá)[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2004, 35(1) : 115-118。
[0018] 曹軼梅，盧曾軍，劉在新，等.大腸埃希氏菌表達(dá)FMDV 3ABC非結(jié)構(gòu)蛋白的純化 復(fù)性與活性檢測[J].中國獸醫(yī)科技，2003, 33(8) :22-25。
[0019] (3)非結(jié)構(gòu)蛋白3B單克隆抗體的制備與鑒定參考以下文獻(xiàn)進(jìn)行：
[0020] 李永亮，田美娜，盧曾軍，等.口蹄疫病毒非結(jié)構(gòu)蛋白3B單克隆抗體的制備和 鑒定[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009, 25(2) :296-300。
[0021] 實施例1 :口蹄疫病毒3A單克隆抗體包被捕獲3ABC酶標(biāo)板的包被方法
[0022] (1)包被：用包被緩沖液（0· 05mol/L pH 9. 6碳酸鹽緩沖液）稀釋3A單抗至工作 濃度為1:10000,加入酶標(biāo)板，每孔加100 μ L，4°c過夜，用PBS洗滌5次。
[0023] ⑵封閉：每孔加封閉液（含1 %魚明膠的PBS溶液）100 μ L，37°C封閉lh，用PBST 洗滌3次。
[0024] (3)捕獲3ABC蛋白：用0·Olmol/L PBS緩沖液稀釋3ABC蛋白至工作濃度為1μg/ mL，每孔100 μ L加入酶標(biāo)板，37°C反應(yīng)lh，PBS洗滌3次。
[0025] (4)加固相抗原穩(wěn)定劑：配制含不同濃度鹿糖（50g/L與100g/L)和不同濃度牛 血清白蛋白（1〇、30、50與100g/L)的0.01m 〇l/L磷酸鹽緩沖液（pH 7. 5)，檢測其保護(hù)間接 包被抗原穩(wěn)定性的效果。每孔加入120 μ L，室溫作用30min，棄殘液；酶標(biāo)板置室溫、濕度 20%~30%的潔凈空間，抽濕機(jī)抽干約12小時。將徹底干燥的酶標(biāo)板置透明塑封袋中，加 干燥劑抽真空密封保存。
[0026] (5)加待測血清：用含1% BSA的PBST稀釋