一種檢測ad的方法及尿液多肽組ad生物標記物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及AD生物標記物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種檢測AD的方法及尿液多肽組AD生物標記物。
【背景技術(shù)】
[0002]作為老年癡呆癥的最常見類型，阿爾茨海默病(Alzheimer’ s disease，AD)是一種由于大腦神經(jīng)細胞死亡而導(dǎo)致的神經(jīng)退行性疾病，因由德國精神病學(xué)家和神經(jīng)病理學(xué)家Alois Alzheimer于1907年首先報道而命名。AD癥的臨床表現(xiàn)為認知功能衰退、記憶力下降、智力惡化和日常生活能力不斷減退，并伴隨有各種神經(jīng)精神異常和行為障礙。因此，與絕大多數(shù)其它疾病不同，AD癥所喪失的是情感和尊嚴等人類的本質(zhì)特征。美國阿爾茨海默病協(xié)會(Alzhermer’ s Associat1n)統(tǒng)計，到2000年，美國65歲以上人口占總?cè)丝诘谋壤s為4.5%，當年美國新增AD癥患者為41.1萬。十年后的2010年，以上兩個數(shù)字分別增至5.1%和45.4萬。截至2012年，全世界大約有3560萬名AD患者，占世界總?cè)丝诘?.5%。根據(jù)《2010年世界阿爾茨海默病》報告的數(shù)據(jù)，全世界老年癡呆癥的人數(shù)每20年將增加1倍。流行病學(xué)研究表明，在發(fā)達國家老年癡呆癥患者的人數(shù)呈線性增加，但是，在低收入國家老年癡呆癥患者的人數(shù)呈現(xiàn)的卻是指數(shù)增加的態(tài)勢。我國老年人口基數(shù)眾多，老齡化速度加快的同時AD的發(fā)病率逐年增長，預(yù)計在未來50年內(nèi)我國AD的發(fā)病率將會增加3倍。2011?2015年，全國60歲以上老年人將由1.78億增加到2.21億，平均每年增加老年人860萬；老年人口比重將由13.3%增加到16%?！吨袊淆g事業(yè)發(fā)展“十二五”規(guī)劃》指出:未來20年，我國人口老齡化日益加重，到2030年全國老年人口規(guī)模將會翻一番。但是，AD癥尚未引起中國社會的足夠重視，例如，病人的就診率偏低，很多人沒有將其作為一種疾病，也沒有意識到AD帶來的社會、經(jīng)濟、醫(yī)療護理的負擔將日益嚴峻。
[0003]AD主要的病理特征為老年斑(senile plaque，SP)、神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)及神經(jīng)元和神經(jīng)突觸的丟失。老年斑的主要成分是β -淀粉樣蛋白(β -amyloid, Αβ )，主要存在于大腦皮質(zhì)、神經(jīng)節(jié)、白質(zhì)、腦干和小腦中，老年斑的周圍纏繞退化的神經(jīng)元和神經(jīng)軸突。但總體上AD是由多種病發(fā)因素引起的綜合性疾病，這也可以解釋為什么十年來以單一靶點為目標的包括抗體、疫苗和小分子在內(nèi)的藥物都失敗在III期臨床，無一成功。目前臨床上使用的安理申等西藥對治療AD癥有一定作用，但也只限于早期患者，并且不能停藥，一旦停藥之后患者病情急劇惡化。目前AD尚無法治愈，預(yù)防和延緩AD的發(fā)生是控制AD的最可行的有效途徑。AD按照病情發(fā)展程度可分為臨床前階段、輕度認知障礙、早期癡呆、中期癡呆和重度癡呆。但是，AD的病理學(xué)改變有可能在出現(xiàn)認知功能障礙的5-10年就已經(jīng)發(fā)生，因此，發(fā)現(xiàn)有效的AD早期診斷標志物對AD的預(yù)防和延緩至關(guān)重要。
[0004]AD最顯著的病理學(xué)特征是腦內(nèi)的淀粉樣蛋白沉積和神經(jīng)纖維纏結(jié)，其產(chǎn)生原因分別是淀粉樣蛋白和微管相關(guān)蛋白Tau的過度磷酸化，因此，腦脊液中淀粉樣蛋白、總Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的水平以及它們的組合被認為是AD生物標志物的最主要標志。但是，腦脊液檢測的創(chuàng)傷性限制了該標志物的應(yīng)用，特別是在無明顯認知功能障礙時，對腦脊液檢測的抵觸甚至大于對AD癥的關(guān)切。另外，在不同實驗室之間甚至同一實驗室之內(nèi)這些檢測結(jié)果的變動很大。
[0005]多肽組學(xué)是以機體內(nèi)源性多肽和低分子量蛋白質(zhì)為研究對象，研究多肽組的成分、功能、變化規(guī)律及其相關(guān)關(guān)系。蛋白質(zhì)是生命功能的執(zhí)行者和體現(xiàn)者，蛋白質(zhì)代謝的異常也會通過其在體內(nèi)的降解在多肽組學(xué)的水平反映出來。對于AD癥等慢性疾病，蛋白質(zhì)分子水平的變化往往早于臨床癥狀的改變。但是，現(xiàn)有技術(shù)中不存在應(yīng)用多肽組以尋找簡單和無創(chuàng)的AD生物標志物。
[0006]因此，現(xiàn)有技術(shù)還有待于改進和發(fā)展。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種檢測AD的方法及尿液多肽組AD生物標記物，旨在解決現(xiàn)有AD生物標記物應(yīng)用受到限制和檢測結(jié)果變動很大的問題。
[0008]本發(fā)明的技術(shù)方案如下:
一種AD的尿液多肽組AD生物標記物，其中，所述尿液多肽組AD生物標記物為組蛋白降解產(chǎn)物、炎癥蛋白降解產(chǎn)物、能量代謝蛋白降解產(chǎn)物中的一種或多種。
[0009]所述的AD的尿液多肽組AD生物標記物，其中，所述組蛋白降解產(chǎn)物為HistoneH2B，Histone H2A，Histone Η3.2，Histone Η4，Histone H2B type 1_J，Histone H1.2，Histone H3.1t，Histone H1.4，Histone H2A.Z 和 Histone H1.5 中的一種或多種。
[0010]所述的AD的尿液多肽組AD生物標記物，其中，所述炎癥蛋白降解產(chǎn)物為Alpha-l-antichymotrypsin? Osteopontin， Protein S100-A8， Protein S100-A12 和Ceruloplasmin中的一種或多種。
[0011]所述的AD的尿液多肽組AD生物標記物，其中，所述能量代謝蛋白降解產(chǎn)物為 Transketolase 降解產(chǎn)物，Pyruvate kinase isozymes M1/M2 降解產(chǎn)物，Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 降解產(chǎn)物，Phosphoglycerate kinase 1 降解產(chǎn)物和Cathepsin G的降解產(chǎn)物中的一種或多種。
[0012]所述的AD的尿液多肽組AD生物標記物，其中，所述尿液多肽組AD生物標記物還包括 Haptoglobin，Apolipoprotein A_I，Vimentin，Ig lambda-2 chain C reg1ns，Thymosin beta—4，Actin，Beta-2_microglobulin ，Plasma serine protease inhibitor，Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4， Carboxypeptidase B2 和 Fibrinogenbeta chain中的一種或多種。
[0013]一種基于如上任一所述AD的尿液多肽組AD生物標記物檢測AD的方法，其中，包括步驟:
A、取1.0?2.0mLAD患者的尿液樣品，離心10?15min后取上清，按照上清尿液30 mg/mL與LaGM復(fù)合材料=(40?60):1的重量比例加入該復(fù)合材料，充分渦旋后室溫振蕩10?15min ；
B、離心5?lOmin，磁分離，去掉上清，在去上清后的沉淀中加入450?500uL水，充分渦旋后室溫振蕩5?lOmin，離心，磁分離，去掉上清，重復(fù)2次； C、在步驟B去上清后的沉淀中加入20uL80%+l%TFA的洗脫液，磁分離，收集上清，重復(fù)1次，冷凍干燥，得到檢測尿液；
D、檢測步驟C得到的檢測尿液中是否存在組蛋白降解產(chǎn)物、炎癥蛋白降解產(chǎn)物、能量代謝蛋白降解產(chǎn)物中的一種或多種。
[0014]所述的檢測AD的方法，其中，包括步驟:
A’、取1.5mLAD患者的尿液樣品，lOOOOrpm離心lOmin后取上清，按照上清尿液30 mg/mL與LaGM復(fù)合材料=50:1的重量比例加入該復(fù)合材料，充分渦旋2min后1000r室溫振蕩 lOmin ；
B’、10000r離心5min，磁分離，去掉上清，在去上清后的沉淀中加入500uL水，充分渦旋lmin,室溫振蕩5min，10000r離心5min磁分離，去掉上清，重復(fù)2次；
C’、在步驟B’去上清后的沉淀中加入20uL80%+l%TFA的洗脫液，磁分離，收集上清，重復(fù)1次，冷凍干燥，得到檢測尿液；
D’、檢測步驟C’得到的檢測尿液中是否存在組蛋白降解產(chǎn)物、炎癥蛋白降解產(chǎn)物、能量代謝蛋白降解產(chǎn)物中的一種或多種。
[0015]所述的檢測AD的方法，其中，所述步驟DSD’中，還包括檢測步驟CSC’得到的檢測尿液中是否存在 Haptoglobin，Apolipoprotein A_I，Vimentin，Ig lambda-2 chainC reg1ns，Thymosin beta-4, Actin, Beta-2-microglobulin，Plasma serine proteaseinhibitor， Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain H4， Carboxypeptidase B2 和Fibrinogen beta chain 中的一種或多種。
[0016]所述的檢測AD的方法，其中，所述步驟D或D’中，通過液相色譜-TripleTOF質(zhì)譜分析對檢測尿液進行檢測。
[0017]所述的檢測AD的方法，其中，所述液相色譜-