一種大薊止血片指紋圖譜的檢測方法及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于中藥成分分析檢測技術(shù)領(lǐng)域，設(shè)及一種大劑止血片指紋圖譜的檢測方 法及其應(yīng)用，具體設(shè)及一種大劑止血片指紋圖譜的檢測方法及其在質(zhì)量檢測中應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 大劑止血片，作為一種中成藥，具有涼血，止血的功效，主治婦女功能性子宮出血， 子宮復(fù)舊不全等。其主要處方組分為大劑4880g和干姜120g。通過將兩味主要處方組分分 別進(jìn)行處理后，將處理液合并，混勻，減壓濃縮成稠膏狀，減壓干燥，粉碎，制粒，壓制成1000 化包衣，即得。
[0003] 其中，大劑為菊科植物劑Cirsiumjaponi州mFisch.exDC.的干燥地上部分。在 臨床上，大劑具有"涼血止血，散疲解毒消癡"功能，主要用于贓血，吐血，尿血，便血，崩漏， 外傷出血，癡腫瘡毒。大劑的化學(xué)成分較為復(fù)雜，主要含有黃酬和黃酬巧類、Ξ祗和醬醇、長 鏈烘（締）醇類等化學(xué)成分。其主要的藥理作用，能夠抗菌、抗腫瘤、抗出血、抗氧化、抗病 毒等。現(xiàn)代藥理研究表明：大劑水提取液具有抗糖尿病的活性作用，其抗糖尿病的活性成分 主要為柳穿魚巧和5, 7-二徑基-6, 4'-二甲氧即黃酬的混合物。
[0004] 而干姜為姜科植物姜ZingiberOfficinaleRose.的干燥根莖。在臨床上，干姜 具有"溫中散寒，回陽通脈，燥濕消疲"功能，主要用于腕腹冷痛，嘔吐泄瀉，肢冷脈微，寒飲 喘咳。干姜含揮發(fā)油約2%，主要成分是姜締、水芹締、茨締、姜締酬、姜辣素、姜酬、龍腦、姜 醇、巧樣醒等。尚含樹脂、淀粉，W及多種氨基酸。其水提取物或揮發(fā)油能明顯延長大鼠實(shí) 驗(yàn)性血栓形成時(shí)間。
[0005] 中藥指紋圖譜具有整體、宏觀、模糊分析等特點(diǎn)，可通過對(duì)中藥整體特征的描 述，采用適當(dāng)模糊處理方式，達(dá)到整體質(zhì)量控制的目的，因此成為中藥質(zhì)量控制的有效手 段。其中色譜指紋圖譜分析可W使中藥所含多種化學(xué)組分的整體特征可視化，從而披露 出常規(guī)檢驗(yàn)難W發(fā)現(xiàn)的質(zhì)量問題。目前在《中藥部頒標(biāo)準(zhǔn)（第13冊）》收載，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)： WS3-B-2468-97,其采用簡單的薄層色譜法定性，難W較好地控制大劑止血片的質(zhì)量。因此， 有必要建立大劑止血片的指紋圖譜，能夠完成對(duì)大劑止血片中成分的定性分析，W便對(duì)大 劑止血片進(jìn)行有效的質(zhì)量控制。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 鑒于W上所述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種大劑止血片指紋圖譜 的檢測方法及其應(yīng)用，采用優(yōu)化條件的前處理及高效液相色譜方法建立了大劑止血片中成 分的指紋圖譜。本發(fā)明中方法通過指紋圖譜可W比較全面的反映大劑止血片中成分的現(xiàn) 狀，提高大劑止血片中成分的質(zhì)控水平。
[0007] 為實(shí)現(xiàn)上述目的及其他相關(guān)目的，本發(fā)明第一方面提供一種大劑止血片指紋圖譜 的檢測方法，包括下列步驟：
[0008] 1)供試品溶液的制備：稱取大劑止血片粉末，加入乙醇水溶液，超聲提取后過濾， 即得供試品溶液；
[0009] 優(yōu)選地，所述大劑止血片加入的重量與所述乙醇水溶液加入的體積之比為1: 5-100 (g/ml)。更優(yōu)選地，所述大劑止血片加入的重量與所述乙醇水溶液加入的體積之比為 1 :50(g/ml)。所述大劑止血片和乙醇水溶液稱取時(shí)，應(yīng)當(dāng)精密稱取。
[0010] 優(yōu)選地，所述大劑止血片粉末與乙醇水溶液在超聲提取前，要稱重，并在超聲提取 后靜置冷卻，再稱重，用乙醇水溶液補(bǔ)足失重。
[0011] 優(yōu)選地，所述超聲提取時(shí)間為15-60min。更優(yōu)選的，所述超聲提取時(shí)間為30min。 所述超聲提取在密閉容器中進(jìn)行，所述密閉容器為密塞的錐形瓶。
[0012] 優(yōu)選地，所述過濾的方式為濾膜過濾方式。更優(yōu)選地，所述濾膜的孔徑為0. 22μm。
[0013] 2)對(duì)照品溶液的制備：分別稱取蘆下、蒙花巧和柳穿魚葉巧對(duì)照品，加入乙醇水 溶液溶解，配成對(duì)照品溶液；
[0014] 優(yōu)選地，所述對(duì)照品溶液中蘆下的CAS號(hào)為153-18-4,蒙花巧的CAS號(hào)為 480-36-4,柳穿魚葉巧的CAS號(hào)為28978-02-1。
[0015] 優(yōu)選地，所述參照品溶液中蘆下、蒙花巧和柳穿魚葉巧的濃度均為10-100μg/ml。 更優(yōu)選地，所述參照品溶液中蘆下、蒙花巧和柳穿魚葉巧的濃度均為50μg/ml。
[0016] 優(yōu)選地，所述對(duì)照品溶液通過先配制對(duì)照品儲(chǔ)備液，再通過對(duì)照品儲(chǔ)備液稀釋間 接配制。
[0017] 更優(yōu)選地，所述對(duì)照品儲(chǔ)備液是定量稱取對(duì)照品，加入乙醇水溶液溶解并定容配 審IJ。所述對(duì)照品儲(chǔ)備液在4°c的冰箱中避光保存。
[0018] 更優(yōu)選地，所述對(duì)照品溶液是定量移取對(duì)照品儲(chǔ)備液，加入乙醇水溶液稀釋并定 容配制。
[0019] 優(yōu)選地，步驟1)或2)中，所述乙醇水溶液為體積百分比濃度為50-100%的乙醇水 溶液。
[0020] 更優(yōu)選地，所述乙醇水溶液為體積百分比濃度為70%的乙醇水溶液。
[0021] 3)測定：采用相同色譜條件的高效液相色譜OPLC)法分別測定供試品溶液和對(duì) 照品溶液，獲得供試品溶液的指紋圖譜和對(duì)照品溶液的指紋圖譜。
[0022] 優(yōu)選地，所述供試品溶液的指紋圖譜，要與對(duì)照品溶液的指紋圖譜進(jìn)行比較，根據(jù) 對(duì)照品溶液的指紋圖譜中的已知特征峰，通過相對(duì)保留時(shí)間，指認(rèn)出供試品溶液的指紋圖 譜中的相應(yīng)特征峰，從而對(duì)供試品溶液指紋圖譜中的指標(biāo)成分進(jìn)行歸屬定位。上述方法為 本領(lǐng)域常規(guī)的指紋圖譜比較及鑒定方法，能夠有效節(jié)約檢測成本。
[0023] 優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的色譜條件為：色譜柱：T3柱；柱溫：25-35°C;檢測 波長：200-500nm掃描；選定波長：300-350nm;流速：0. 5-1. 5ml/min;進(jìn)樣量：2-10μ1 ;流 動(dòng)相：乙臘-0. 1-0. 2ν/ν%憐酸水溶液，其中，A相為乙臘，Β相為0.1-0. 2ν/ν%憐酸水溶液； 分析時(shí)間：90min;梯度洗脫。
[0024] 更優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的色譜條件為：色譜柱：WatersAtlantisT3色譜 柱（4.6mmX250mm，5μm);柱溫：30°C;檢測波長：200-500nm掃描；選定波長：330nm;流速： l.Oml/min;進(jìn)樣量：5μ1 ;流動(dòng)相：乙臘-0.Iv/v%憐酸水溶液，其中，A相為乙臘，B相為 0.Iv/v%憐酸水溶液；分析時(shí)間：90min;梯度洗脫。
[00巧]最優(yōu)選地，如表1所示，所述梯度洗脫的具體程序?yàn)椋?br>[0026] 0-20min，A相：B相體積比為 10 :90-20 :80 ;
[0027] 20-43min，A 相：B 相體積比為 20 :80-26 :74 ;
[0028] 43-55min，A 相：B 相體積比為 26 :74-35 :65;
[0029] 55-75min，A 相：B 相體積比為 35 :65-60 :40; W30] 75-80min，A 相：B 相體積比為 60 :40-95 :5 ;
[0031] 80-82min，A相：B相體積比為 95 :5-10 :90;
[0032] 82-90min，A相：B相體積比為 10 :90-10 :90。
[003引表1梯度洗脫
[0034]
陽035] 本發(fā)明第二方面提供一種大劑止血片指紋圖譜的檢測方法，在大劑止血片中成分 的質(zhì)量檢測中的應(yīng)用。
[0036] 本發(fā)明第Ξ方面提供一種大劑止血片的質(zhì)量檢測方法，包括采用前述大劑止血片 指紋圖譜的檢測方法獲得供試品的指紋圖譜，將得到的供試品的指紋圖譜與相同指紋圖譜 檢測條件下獲得的大劑止血片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行相似度比較。
[0037] 優(yōu)選地，本發(fā)明將測得的大劑止血片的指紋圖譜與大劑止血片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn) 行相似度的比較時(shí)，采用國家藥典委員會(huì)發(fā)布的《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》2009 版軟件進(jìn)行比較。更優(yōu)選地，本發(fā)明測得的大劑止血片的指紋圖譜與大劑止血片標(biāo)準(zhǔn)指紋 圖譜的相似度> 0.95。
[0038] 優(yōu)選地，采用與前述大劑止血片指紋圖譜的檢測方法相同的條件得到大劑止血 片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜，所述大劑止血片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜包括17個(gè)共有指紋峰，W17號(hào)峰（S 峰）為內(nèi)參比峰，其他16個(gè)共有指紋峰的相對(duì)保留時(shí)間依次為1號(hào)峰（0. 120 + 0.001)、 2 號(hào)峰（0.175 + 0. 001)、3 號(hào)峰（0.186 + 0. 002)、4 號(hào)峰（0.260 + 0. 001)、5 號(hào)峰 (0. 311 + 0. 002)、6 號(hào)峰（0. 386 + 0. 003)、7 號(hào)峰（0. 395 + 0. 003)、8 號(hào)峰（0. 411 + 0. 003)、 9 號(hào)峰（0.439 + 0. 003)、10 號(hào)峰（0.447 + 0. 003)、11 號(hào)峰（0.477 + 0. 003)、12 號(hào) 峰（0.486 + 0. 003)、13 號(hào)峰（0.657 + 0. 002)、14 號(hào)峰（0.673 + 0. 002)、15 號(hào)峰 (0. 812 + 0. 002)、16 號(hào)峰（0. 825 + 0. 002)。
[0039] 更優(yōu)選地，所述大劑止血片的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜與對(duì)照品溶液的指紋圖譜進(jìn)行比較， 定位確定所述13號(hào)峰為蒙花巧的指紋峰，所述14號(hào)峰為柳穿魚葉巧的指紋峰。
[0040] 本發(fā)明中的用水均為純凈水。
[0041] 如上所述，本發(fā)明的一種大劑止血片指紋圖譜的檢測方法及其應(yīng)用，采