人工抗體的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及材料科學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及探測百草枯分子的PS@Si02人工抗體的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)病、蟲、草害防治和保證農(nóng)作物高產(chǎn)增收方面發(fā)揮著巨大作用的同時也對生態(tài)壞境和人類健康造成了嚴重威脅，引起各國政府和國際社會的高度關(guān)注。據(jù)統(tǒng)計全世界每年由食品質(zhì)量引發(fā)的病例大約在15億次，并導(dǎo)致大約3百萬人死亡，尤其是農(nóng)藥在農(nóng)牧產(chǎn)品和食品中的殘留，對人體具有慢性毒性、“三致”(致癌、致畸、致突變)效應(yīng)和環(huán)境激素效應(yīng)。劇毒農(nóng)藥在農(nóng)產(chǎn)品中的殘留直接造成中毒的事件也時有發(fā)生。農(nóng)藥殘留對我國食品安全構(gòu)成了長期的嚴重威脅，近年來，公眾對農(nóng)產(chǎn)品和食品的安全感明顯下降，農(nóng)牧產(chǎn)品和食品中農(nóng)藥殘留問題多次引發(fā)國際貿(mào)易爭端，嚴重影響我國農(nóng)產(chǎn)品和食品在國際市場的競爭力。因此，農(nóng)藥殘留的快速痕量檢測是目前國家亟待解決的挑戰(zhàn)性難題，也是國際社會普遍關(guān)心的重要研究領(lǐng)域，急需先進的傳感材料和快速、靈敏和可靠的分析檢測技術(shù)解決農(nóng)牧廣品和食品中農(nóng)藥殘留痕量檢測所面臨的挑戰(zhàn)。
[0003]農(nóng)藥作為對生態(tài)環(huán)境和食品的重要污染源之一，日益受到各國政府和公眾的關(guān)注。其分析技術(shù)研究也引起了各國研究機構(gòu)的高度重視，新的分析方法，特別是多種類型農(nóng)藥的多殘留分析方法、同類型農(nóng)藥的多殘留分析方法以及新的單個農(nóng)藥在多種試樣中的分析方法都取得了重要進展(Greulich, Κ.; Alder, L.Anal.B1anal.Chem.2008,391, 183.)0目前，主要的農(nóng)藥殘留檢測方法為氣相色譜法、高效液相色譜法、薄層層析法、毛細管電泳、氣-質(zhì)聯(lián)用分析法和液-質(zhì)聯(lián)用分析法等。這些方法靈敏度高，但是所需儀器昂貴，樣品前處理復(fù)雜、耗時長(Grimalt, S.; Pozo, Oscar J.; Sancho, J.V.;Hernandez, F.Anal.Chem.2007, 79, 2833.；Garcla-Reyes, J.F.; Hernando, M.D.;Ferrer, C.; Molina-Dlaz, A.; Fernandez-Alba, A.R.Anal.Chem.2007, 79, 7308.；Hernendez, F.; Portoles, T.; Pitarch, E.; Lopez.F.J.Anal.Chem.2007, 79,9494.)0近年來，利用生物免疫傳感器快速檢測農(nóng)藥殘留取得一定的進步(Ramon-Azcon,J.; Kunikata, R.; Sanchez, F.J.; Marco, M.P.; Shiku, H.; Yasukawa, T.; Matsue,T.B1sens.B1electron.2009, 24, 1592.)。如利用農(nóng)藥與特異性抗體結(jié)合反應(yīng)特性研制免疫傳感器，可用于對相應(yīng)農(nóng)藥殘留進行快速定量定性檢測。免疫傳感器利用的是抗體和抗原之間的免疫化學(xué)反應(yīng)，抗體可與其獨特的抗原高度專一地可逆結(jié)合，其間有靜電力、氫鍵、疏水作用和范德華力，將抗體固定在固相載體上，可從復(fù)雜的基質(zhì)中富集抗原目標物，達到測定目標物濃度的目的。為了提高化學(xué)生物傳感器對目標分析物的選擇性和專一性，普遍使用抗體、酶、多肽和核酸作為分子識別元素。然而，生物敏感材料如抗體、酶、特異蛋白和DNA等生物分子性質(zhì)不穩(wěn)定，受環(huán)境影響大，價格極為昂貴。使用生物敏感材料制作的生物納米傳感器比較脆弱，使用壽命短，在苛刻條件下可能失去敏感特性。因此，使用人工合成的仿生敏感材料(人工抗體)來代替生物敏感材料是化學(xué)/生物傳感器未來應(yīng)用的關(guān)鍵。
[0004]分子印記技術(shù)是通過模板分子(目標分子)與功能單體以共價鍵或非共價鍵相互作用，將模板分子固定在交聯(lián)的聚合物網(wǎng)絡(luò)中，模板分子的除去，留下與模板分子的形狀和功能相匹配的孔洞，從而在合成材料中創(chuàng)造出具有高親和力和高選擇性的分子識別位點(人工抗體)(ffulff, G.Chem.Rev., 2002, 102，1.；ffulff, G.Angev.Chem.1nt.Ed.1995, 34, 1812.；Haupt, K.; Mosbach, K..Chem.Rev.2000, 100, 2495.；Zimmerman,
S.C.; Lemcoff, N.G.Chem.Commun.2004, 5.)。這是一種人工合成的具有高親和力和高選擇性分子識別人工抗體材料的有效手段。分子印記材料具有物理和化學(xué)穩(wěn)定性高、成本低、制備容易和可重復(fù)使用等優(yōu)點，因此，在化學(xué)與生物傳感器、分離技術(shù)、催化、藥物輸送等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景(Katz, A.; Davis, Μ.Ε.Nature, 2000, 403，286.；Bass,J.D.; Katz, A.Chem.Mater.2003, 15, 2757.；Zimmerman, S.C.; ffendland, M.S.;Rakow, N.A.; Suslick, K.S.Nature2QQ2, 418, 399.；Mertz, E.; Zimmerman, S.C.J.Am.Chem.Soc.2003, 125，3424.)。近年來，Hayden使用分子印記的石英微重力天平可檢測病毒和分辯血型(Dichet, F.E.; Hayden, D.; Bindeus, R.Anal.B1anal.Chem.2004, 318, 1929.；Hayden, 0.; Mann, K.J.; Krassnig, S.; Dickert, F.L.Angev.Chem.1nt.Ed.2006, 45，2626.)。Nesterov 報道了分子印記的半導(dǎo)體發(fā)光聚合物傳感器對TNT 的檢測(Li, J.Η.; Kendig, C.Ε.; Nesterov, E.E.J.Am.Chem.Soc.2007, 129, 15911.)。基于仿生分子印記的化學(xué)生物傳感器正在吸引化學(xué)家們的強烈研究興趣。
[0005]浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院齊沛沛等人公開了發(fā)明專利(CN201210208302.9) “一種克百威分子印記微球及其制備和應(yīng)用”，將模板分子和功能單體溶解到含交聯(lián)劑和引發(fā)劑的致孔劑溶液中得到反應(yīng)混合液，進行超聲脫氣、通氮氣除氧后在密封狀態(tài)下進行聚合反應(yīng)，反應(yīng)完全之后，進行離心分離，得到白色粉末狀聚合物，依次采用甲醇乙酸混合液、甲醇為提取溶劑進行索氏抽提，真空干燥后除去溶劑，得到克百威分子印記微球。該發(fā)明還公開了由該制備方法制備得到的克百威分子印記微球及其應(yīng)用。該發(fā)明得到的克百威分子印記微球?qū)r(nóng)產(chǎn)品中的克百威具有特異選擇性，能夠快速、靈敏、準確、高效地對農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留進行檢測，還可以作為固相萃取填料。國家海洋局天津海水淡化與綜合利用研究所劉靜等人公開了發(fā)明專利(CN201210368919.7 ) “ 一種制備水質(zhì)檢測用對硫磷分子印記聚合物的方法”，該方法以對硫磷為模板分子，通過紫外光引發(fā)聚合制備適合水環(huán)境中有機磷檢測的對硫磷分子印記聚合物。采用該發(fā)明制備的對硫磷分子印記聚合物，聚合時間短，吸附性能好；以制備的對硫磷分子印記聚合物為固相萃取柱填料，采用固相萃取-氣相色譜法能快速有效地分析水中有機磷農(nóng)藥，其分離效果好，雜質(zhì)干擾少，檢出限低，靈敏度、精密度高，回收效果好，可滿足水中痕量有機磷檢測要求。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)潘燦平等人公開了發(fā)明專利(CN200910238781.7) “一種分子印記聚合物及其制備方法與應(yīng)用”，該分子印記聚合物是按照如下方法制備的，將聚合反應(yīng)單體、交聯(lián)劑、致孔劑、引發(fā)劑和印記分子二乙基(3-甲基脲)(苯基)甲基磷酸酯混合，在熱引發(fā)或光引發(fā)條件下進行原位聚合反應(yīng)，得到含有二乙基(3-甲基脲)(苯基)甲基磷酸酯的聚合物；清洗上述聚合物直至檢測不到印記分子；然后用有機溶劑清洗至中性，真空下干燥，即制得本發(fā)明的分子印記聚合物。該發(fā)明還公開了該分子印記聚合物在分離純化、測定樣本中的有機磷類殺蟲劑方面的應(yīng)用，該聚合物的應(yīng)用避免了目標分析物模板泄露對后續(xù)吸附實驗的影響，可同時對多種目標分子進行檢測，加寬了目標分子的檢測范圍。江蘇大學(xué)陳冠華等人公開了發(fā)明專利(CN201110177262.1)“一種殺蟲脒分子印記固相萃取柱的制備方法和應(yīng)用”，該發(fā)明以殺蟲脒為模板，甲基丙烯酸為功能單體，乙二醇二甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，偶氮二異丁腈為引發(fā)劑，乙腈為致孔劑，采用本體聚合法合成分子印記聚合物。將分子印記聚合物顆粒均勻填充于固相萃取柱內(nèi)，得到殺蟲脒分子印記固相萃取柱；以乙腈為上樣溶劑、乙腈-丙酮為淋洗溶劑、甲醇-乙酸為洗脫溶劑，實現(xiàn)了蜂蜜樣品中殺蟲脒的分離、富集。與以往的普通萃取法等相關(guān)技術(shù)相比，富集、凈化效率高，并且殺蟲脒分子印記固相萃取小柱可以重復(fù)使用，成本低，可望成為蜂蜜樣品中殺蟲脒殘留前處理的必備手段。安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)湯鋒等人公開了發(fā)明專利(CN200810246208.6) “取代脲類農(nóng)藥分子印記固相萃取小柱的制備方法”，該發(fā)明將模板分子取代脲類農(nóng)藥、功能單體甲基丙烯酸和交聯(lián)劑二甲基丙烯酸乙二醇酯，按模板分子:功能單體:交聯(lián)劑摩爾比為1: 28: 20，通過懸浮聚合而成取代脲類農(nóng)藥分子印記聚合物微球；再稱量取代脲類農(nóng)藥分子印記聚合物微球，填充于聚丙烯固相萃取小柱空管內(nèi)，制得取代脲類農(nóng)藥分子印記固相萃取小柱。該發(fā)明制得的取代脲類農(nóng)藥分子印記固相萃取小柱用于檢測食品和環(huán)境中取代脲類農(nóng)藥殘留樣品提取溶液的選擇性純化、富集。與普通液-液萃取法、C18固相萃取法相比，該發(fā)明具有簡單、快速、凈化效率高等特點。
[0006]分子印記材料要真正應(yīng)用到實際樣品中痕量農(nóng)藥殘留組分選擇性的分離、快速的富集，并以敏感的光學(xué)信號輸出，分子印記材料應(yīng)該具備對目標分子具有高親和力，快速結(jié)合動力學(xué)，能夠后功能化以及一致材料形態(tài)等要求。在信號輸出方面領(lǐng)域研究中東北林業(yè)大學(xué)陳立鋼等人公開了發(fā)明專利(CN201410006545.3) “一種分子印記一焚光量子點雙功能復(fù)合微球的制備及在氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用”，該發(fā)明的目的是要解決現(xiàn)有氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析中前處理步驟繁瑣，大量消耗有機溶劑，分析時間長，成本高和對操作人員危害大的問題。步驟:一、合成摻雜型量子點ZnS:Mn ;二、制備分子印記一熒光量子點雙功能復(fù)合微球；一種分子印記一熒光量子點雙功能復(fù)合微球在氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留分析中的應(yīng)用方法步驟:一、混合；二、檢測。優(yōu)點:測定的加標回收率為94°/『99% ;降低分析成本50%~70%。本發(fā)明適用于一種分子印記一焚光量子點雙功能復(fù)合微球的制備及應(yīng)用方法。天津科技大學(xué)王碩等人公開了發(fā)明專利(CN201410446636.9) “一種上轉(zhuǎn)換熒光分子印記聚合物及其制備方法”，該發(fā)明提供一種上轉(zhuǎn)換熒光分子印記聚合物及其制備方法，涉及新型高分子富集材料領(lǐng)域，將上轉(zhuǎn)換熒光納米顆粒NaYF4: Yb3+，Er3+作為一種新型載體，與分子印記技術(shù)相結(jié)合，具體涉及一種對氨基甲酸酯類農(nóng)藥速滅威分子具有良好的吸附和分離功能的上轉(zhuǎn)換熒光納米分子印記聚合物及其制備方法，合成出的產(chǎn)物比表面積較大，使其傳質(zhì)速率和吸附量較以往材料有很大的提高。