Ehd2抗體在制備肺癌免疫組化檢測(cè)試劑中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種E皿2抗體在制備肺癌免疫組化檢測(cè)試 劑中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺癌的全稱為"原發(fā)性支氣管肺癌"，其發(fā)病率及死亡率近年來(lái)上升速度極快。我 國(guó)肺癌發(fā)病的重點(diǎn)在城市，發(fā)病率男性為癌癥發(fā)病的第一位，女性為癌癥發(fā)病的第Ξ位。肺 癌的治愈率很低，尚屬于一種很難治愈的癌癥，究其原因在于病程進(jìn)展快，發(fā)現(xiàn)、診斷和治 療則相對(duì)較晚，早期的發(fā)現(xiàn)和診斷對(duì)肺癌的治愈至關(guān)重要。
[0003] 目前在臨床上對(duì)肺癌的惡性度判別主要還是基于在組織病理水平對(duì)腫瘤組織和 腫瘤細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察，它對(duì)癌細(xì)胞的分化程度和侵犯特性有較強(qiáng)的辨別能力。但 是，運(yùn)種基于形態(tài)學(xué)的解讀一方面受病理醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)等人為因素影響，另一方面缺乏更深層 次的與病人個(gè)體發(fā)病因素相關(guān)的分子依據(jù)。對(duì)肺癌的發(fā)生根源，即基因或相關(guān)功能性蛋白 等分子進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)肺癌診斷及預(yù)后判斷具有重要意義，免疫組織化學(xué)檢測(cè)是深刻認(rèn)識(shí)和 有效控制腫瘤惡性本質(zhì)的非常重要的方法。
[0004]免疫組織化學(xué)技術(shù)應(yīng)用免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)基本原理，通過(guò)抗體對(duì)體內(nèi)蛋白質(zhì)分 子抗原的特異性識(shí)別，W及化學(xué)標(biāo)記（巧光素、酶、金屬離子、同位素等）的第二抗體的顯色 等作用來(lái)檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)抗原（多膚和蛋白質(zhì)）的表達(dá)量及其亞細(xì)胞定位。近年來(lái)， 隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)的發(fā)展和各種特異性抗體的成功研發(fā)，更主要的是對(duì)腫瘤分子機(jī)制 認(rèn)識(shí)的不斷深入，免疫組化在腫瘤的分子診斷與鑒別中的應(yīng)用價(jià)值受到了普遍的認(rèn)可。
[0005] 本申請(qǐng)項(xiàng)目前期研究發(fā)現(xiàn)E皿2蛋白的表達(dá)與定位在肺癌中產(chǎn)生 異變，自主研發(fā)的E皿2特異抗體可用于肺癌的免疫組化檢測(cè)。E皿2巧psin homology巧Η)-domain-containingprotein2)是E皿蛋白的一種，是一類新型膜轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào) 控蛋白，含有高度保守的EH結(jié)構(gòu)域。參與受體內(nèi)吞等胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的多步調(diào)控，是整個(gè)胞膜轉(zhuǎn) 運(yùn)機(jī)制的必不可少的重要環(huán)節(jié)，在多種細(xì)胞中起分子與物質(zhì)運(yùn)輸及信號(hào)傳導(dǎo)等關(guān)鍵作用， 它的失調(diào)將導(dǎo)致細(xì)胞信號(hào)應(yīng)答失當(dāng)及細(xì)胞功能素亂，并可能進(jìn)而引發(fā)疾病。因此對(duì)E皿2 進(jìn)行免疫組化檢測(cè)將更客觀準(zhǔn)確地反映腫瘤的異化本質(zhì)和患者個(gè)體的臨床特性。目前，由 E皿2特異抗體制備的免疫組化試劑未見報(bào)道，E皿2抗體在制備肺癌免疫組化檢測(cè)試劑中 的應(yīng)用也沒有先例。
[0006]為解決上述問題，本發(fā)明公開了一種E皿2特異抗體在制備肺癌免疫組化檢測(cè)試 劑中的應(yīng)用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]為解決【背景技術(shù)】中提到的目前在臨床上對(duì)腫瘤的判別主要還是基于在組織病理 水平對(duì)腫瘤組織和腫瘤細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)形態(tài)學(xué)觀察，受病理醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)等人為因素影響較大， 缺乏更深層次的與病人個(gè)體發(fā)病因素相關(guān)的分子依據(jù)的問題，本發(fā)明公布了E皿2特異抗 體在制備肺癌免疫組化檢測(cè)試劑中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明解決的技術(shù)問題通過(guò)W下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0009] E皿2抗體在制備肺癌免疫組化檢測(cè)試劑中的應(yīng)用，是W-種對(duì)人E皿2蛋白特異 的抗體作為一抗或核屯、抗體。
[0010] 所述E皿2蛋白是指由基因E皿2編碼的蛋白，所述基因E皿2的GeneBank國(guó)際 通用序列編號(hào)為：NM_〇14601，所述基因E皿2編碼蛋白的GeneBank國(guó)際通用序列編號(hào)為： NP-055416。
[0011] 所述一種對(duì)人E皿2蛋白特異的抗體，其特征在于，所述抗體能特異性識(shí)別人E皿2 蛋白，所述識(shí)別位點(diǎn)的氨基酸序列為：503-SEQ ID NO :1-543,由該氨基酸序列構(gòu)成的一種 多膚，其氨基酸序列為SEQ ID N0:1。
[0012] W所述多膚的氨基酸序列為核屯、序列對(duì)其進(jìn)行修飾，所述修飾為在所述多膚N端 連接一個(gè)半脫氨酸；修飾后的所述多膚經(jīng)純化后作為抗原對(duì)動(dòng)物進(jìn)行免疫W制備E皿2抗 體并進(jìn)行抗原純化。
[0013] 所述肺癌免疫組化檢測(cè)試劑，用于對(duì)肺癌組織中E皿2的表達(dá)水平和定位進(jìn)行檢 巧。，其特征是采用前述對(duì)人E皿2蛋白特異的抗體作為一抗或核屯、抗體，配W常規(guī)免疫組化 試劑如二抗、顯色劑及緩沖劑。
[0014] 有益效果
[0015] 本發(fā)明的有益效果為：
[0016] 本發(fā)明公開了E皿2抗體在制備肺癌免疫組化檢測(cè)試劑中的應(yīng)用，由于E皿2蛋白 參與受體與胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的多步調(diào)控，W及在各種細(xì)胞中對(duì)維持物質(zhì)運(yùn)輸與信號(hào)傳導(dǎo)等起關(guān)鍵 作用，與腫瘤等疾病的發(fā)生密切相關(guān)。因此對(duì)E皿2進(jìn)行免疫組化檢測(cè)將更客觀準(zhǔn)確地從分 子水平反映腫瘤的異化本質(zhì)和患者個(gè)體的臨床特點(diǎn)，符合腫瘤的精準(zhǔn)醫(yī)療原則和趨勢(shì)。
[0017] 本發(fā)明公開的E皿2抗體在制備肺癌免疫組化檢測(cè)試劑中的應(yīng)用，W對(duì)人E皿2蛋 白特異的抗體作為一抗或核屯、抗體，制備肺癌免疫組化檢測(cè)試劑，制備出的試劑特異性好， 靈敏度高，顯色性好。
【附圖說(shuō)明】
[001引圖1為免疫印跡檢測(cè)結(jié)果。
[0019] 圖2為肺癌組織200倍鏡下免疫組化圖。左上為癌旁正常組織，右下為癌組織。
[0020] 圖3為肺癌組織200倍鏡下免疫組化圖。
[0021] 圖4為肺癌組織400倍鏡下免疫組化圖。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1 :E皿2特異抗體的制備
[0023] 1)實(shí)驗(yàn)材料來(lái)源
[0024] 新英格蘭大白兔購(gòu)于上海強(qiáng)耀生物。 陽(yáng)0巧]多膚CD邸FALASHLIEAKLEGHGLPANLPRRLVPPSKRRHKGSAE由天津賽爾生物技術(shù)有限 公司定制并與KLH偶聯(lián)。
[0026] CNBr活化的凝膠珠，福氏完全佐劑及福氏不完全佐劑購(gòu)自Invitrigen公司。
[0027]。動(dòng)物免疫 陽(yáng)02引取4月齡新西蘭大白兔3只，將lOOug抗原多膚溶于0. 2ml0. 1MPBS(pH7. 2)， 與等體積福氏完全佐劑充分混勻，腹部皮下多點(diǎn)注射。第一次免疫后第15和29天，分別用 lOOug多膚/0. 2mlPBS與等體積福氏不完全佐劑充分混合后加強(qiáng)免疫。
[0029] 3化皿2抗血清的制備
[0030] 于免疫結(jié)束后一周頸動(dòng)脈取血，37°C靜置3小時(shí)后離屯、取血清。
[0031] 4)抗原凝膠珠制備 陽(yáng)03引 CNBr活化的凝膠珠于ImM肥1中浸泡30分鐘，用偶聯(lián)緩沖液（含0. 1MNa肥03抑 8. 3,和0. 5M化C1)清洗，按Img多膚加1ml凝