保持細(xì)胞應(yīng)力平衡條件下檢測(cè)SSBs結(jié)合狀態(tài)的裝置及方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種保持細(xì)胞應(yīng)力平衡條件下檢測(cè)SSBs結(jié)合狀態(tài)的裝置及方法。
【背景技術(shù)】
[0002]單鏈DNA 結(jié)合蛋白(single strand DNA-binding proteins, SSBs)包括replicat1n protein A(RPA)和端粒保護(hù)蛋白 protect1n of telomeres proteinI (P0T1)。當(dāng)DNA復(fù)制的時(shí)候，雙鏈DNA需要解旋成單鏈DNA并且與單鏈DNA結(jié)合蛋白結(jié)合來(lái)防止形成錯(cuò)誤結(jié)構(gòu)，維護(hù)端粒及基因組的穩(wěn)定性。然而，已分化了的正常體細(xì)胞在非生理的化學(xué)、物理以及炎癥因素干預(yù)下，細(xì)胞會(huì)從其生長(zhǎng)的基質(zhì)上脫離，其細(xì)胞核會(huì)產(chǎn)生劇烈的縮小，與此同時(shí)，與SSBs結(jié)合的染色質(zhì)/DNA會(huì)受到這種縮小和擁擠的細(xì)胞核的壓迫，從而產(chǎn)生適形變化，產(chǎn)生適形變化的SSBs會(huì)從單鏈DNA上脫離。將脫離結(jié)合狀態(tài)的SSBs在保持細(xì)胞完整性的條件下，使其從細(xì)胞中分離出來(lái)，并且保持分離出的SSBs不會(huì)重新進(jìn)入細(xì)胞，至今沒(méi)有這樣的裝置。
[0003]眾所周知，DNA是生物體遺傳密碼-基因的載體，基因組的穩(wěn)定性對(duì)生物體的生物學(xué)行為是至關(guān)重要的?；蚪M的不穩(wěn)定性或基因的變異與人類眾多疾病密切相關(guān)，如癌癥、衰老等等。而SSBs存在于一切真核生物細(xì)胞，SSBs的結(jié)合狀態(tài)對(duì)保證DNA的正確復(fù)制、DNA的損傷修復(fù)以及基因組的穩(wěn)定性具有關(guān)鍵性的作用。然而目前未發(fā)現(xiàn)有關(guān)技術(shù)手段和實(shí)驗(yàn)方法能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)結(jié)構(gòu)完整且保持其應(yīng)力平衡的細(xì)胞核內(nèi)部的SSBs結(jié)合狀態(tài)進(jìn)行檢測(cè)的文獻(xiàn)報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的就是為了提供一種保持細(xì)胞應(yīng)力平衡條件下檢測(cè)SSBs結(jié)合狀態(tài)的裝置及方法。
[0005]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
[0006]—種保持細(xì)胞應(yīng)力平衡條件下檢測(cè)SSBs結(jié)合狀態(tài)的裝置,包括:細(xì)胞電泳槽:該槽為內(nèi)徑0.76?0.84cm(優(yōu)選0.8cm)、外徑0.90?1.0Ocm(優(yōu)選0.95cm)、長(zhǎng)度18.9?17.lcm(優(yōu)選18cm)的聚苯乙烯圓管，管壁中部，沿其縱軸方向開(kāi)有一 8.55X0.57cm?
9.45X0.63cm(優(yōu)選9 X 0.6cm)的矩形槽口 ；電泳緩沖液池:陽(yáng)極、陰極各有一個(gè)，尺寸相同，9.5X3.33X4.75cm ?10.5X3.68X5.25cm (優(yōu)選 10X3.5 X 5cm);材質(zhì):聚苯乙烯；側(cè)連接通道:陽(yáng)極與陰極側(cè)各有一個(gè)，尺寸相同，內(nèi)徑0.76?0.84cm (優(yōu)選0.8cm)，外徑0.90?1.0Ocm (優(yōu)選0.95cm),長(zhǎng)9.5?10.5cm (優(yōu)選1cm)的石圭膠管;濾膜:陽(yáng)極與陰極側(cè)各有一個(gè)，尺寸相同，0.45 μ m 或 0.2 μ m 親水聚苯謎諷(Hydrophilic po lyethersulf one)濾膜；電極:陽(yáng)極與陰極各有一根，5.7?6.3cm (優(yōu)選6cm)長(zhǎng),直徑0.475?0.525cm (優(yōu)選0.5mm)電泳儀用鉬絲。
[0007]細(xì)胞原位電泳(cell in situ electrophoresis, CISE),是將待檢細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，使其單個(gè)游離的細(xì)胞分散于等滲即應(yīng)力平衡的介質(zhì)中，在電場(chǎng)作用下，將細(xì)胞中的物質(zhì)從細(xì)胞中分離出來(lái)的一種電泳方式。
[0008]上述保持細(xì)胞應(yīng)力平衡條件下檢測(cè)SSBs結(jié)合狀態(tài)的裝置，為水平式電泳裝置。
[0009]利用上述裝置檢測(cè)SSBs結(jié)合狀態(tài)的方法，具體包括以下步驟:
[0010]細(xì)胞預(yù)固定:分離處理生長(zhǎng)期細(xì)胞，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)制成細(xì)胞懸液，將上述細(xì)胞懸液涂布于培養(yǎng)皿底部，將上述培養(yǎng)皿置于(TC條件下用UV燈照射(優(yōu)選254nm UV燈以1.84W/cm2強(qiáng)度照射，總劑量165.6J/cm2)后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)收集培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，離心(260g離心5min)棄上清液后加入4%多聚甲酸預(yù)固定1_6(優(yōu)選3)860 ；
[0011]預(yù)固定的目的為:既有應(yīng)力結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞內(nèi)待檢蛋白非變性的狀態(tài)下，經(jīng)受細(xì)胞原位電泳過(guò)程，而不發(fā)生破碎，以保持細(xì)胞完整性，以方便接下來(lái)的打孔。
[0012]細(xì)胞打孔:將上述預(yù)固定的細(xì)胞，加入打空劑，所述打空劑能夠使細(xì)胞膜和細(xì)胞核都打孔，優(yōu)選聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)，濃度為0.2%，細(xì)胞打孔時(shí)間5_15(優(yōu)選 10)min ；
[0013]打孔的目的為:溶解細(xì)胞生物膜上的脂質(zhì)，使單鏈DNA結(jié)合蛋白能夠從細(xì)胞中移出，以方便脫落的單鏈結(jié)合蛋白從細(xì)胞中移出，不破壞細(xì)胞的整體結(jié)構(gòu)。
[0014]細(xì)胞原位電泳(cell in situ electrophoresis, CISE):將上述打孔后的細(xì)胞團(tuán)加入CISE緩沖液(三輕甲基氨基甲燒Tris 25mM ;甘氨酸Glycine: 192mM ;葡萄糖Glucose:43.2mM ；pH8.3)制成細(xì)胞懸液，恒壓模式下，在電泳槽陰極側(cè)滴入細(xì)胞懸液，電泳完成后用移液器吸凈電泳槽中的液體，并將吸出液匯集于一離心管中，用電泳緩沖液沖洗電泳槽，重復(fù)電泳過(guò)程，直至細(xì)胞懸液全部完成電泳；
[0015]在電泳條件下，從DNA單鏈上脫落的單鏈結(jié)合蛋白通過(guò)細(xì)胞上的孔道流出，從而實(shí)現(xiàn)脫落的單鏈結(jié)合蛋白與未脫落的單鏈結(jié)合蛋白的分離；
[0016]優(yōu)選點(diǎn)樣時(shí)，細(xì)胞樣品點(diǎn)在中間泳道距離陰極端1.5cm處(目的是:電泳時(shí)，防止細(xì)胞移動(dòng)至濾膜處從而聚集成團(tuán))，保證電泳時(shí)細(xì)胞不破裂，且減少了單鏈DNA結(jié)合蛋白從一個(gè)細(xì)胞移出后再通過(guò)細(xì)胞上的孔道進(jìn)入另一個(gè)細(xì)胞的概率。電泳的時(shí)間優(yōu)選為3min。
[0017]檢測(cè):使用流式細(xì)胞術(shù)分析檢測(cè)。
[0018]本發(fā)明中所用到的PBS，pH值都為7.4。
[0019]本發(fā)明的有益效果:
[0020]在預(yù)固定時(shí)，將上述培養(yǎng)皿置于(TC條件下用UV燈照射，強(qiáng)化了 SSBs原有的狀態(tài)，保證后續(xù)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確。
[0021]本發(fā)明的裝置能夠使細(xì)胞在保持應(yīng)力平衡狀態(tài)的條件下分離結(jié)合態(tài)SSBs與非結(jié)合 SSBs ο
[0022]本發(fā)明制備的電泳緩沖液可以保持細(xì)胞等滲，保證細(xì)胞完整，選用Glucose是因?yàn)槠錈o(wú)極性，且分子結(jié)構(gòu)不影響后續(xù)的離心，便于細(xì)胞的回收。
[0023]本發(fā)明巧妙的將細(xì)胞原位電泳與細(xì)胞流式分析術(shù)結(jié)合，檢測(cè)結(jié)果客觀準(zhǔn)確。
[0024]本發(fā)明的裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、操作方便和分析結(jié)果客觀的特點(diǎn)。應(yīng)用本發(fā)明方法對(duì)SSBs結(jié)合狀態(tài)的檢測(cè)，呈現(xiàn)出易于判斷的“保持結(jié)合”與“出現(xiàn)解離”兩種結(jié)果。
[0025]本發(fā)明裝置的使用應(yīng)力改變所致細(xì)胞核縮小造成的SSBs解離具有重要的生物學(xué)意義。其級(jí)聯(lián)過(guò)程以及生物學(xué)效應(yīng)可概括為:細(xì)胞收縮-細(xì)胞核壓縮-染色質(zhì)適形變化所導(dǎo)致的基因組不穩(wěn)定性。
[0026]本發(fā)明采用了首先用4%的多聚甲醛200μ I秒級(jí)預(yù)固定，在進(jìn)行流式分析前又用70%的乙醇15ml進(jìn)行二次固定，保證了細(xì)胞在后期的流式分析中細(xì)胞的完整，同時(shí)使得流式分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[0027]用本發(fā)明技術(shù)原創(chuàng)性發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致內(nèi)源性基因組不穩(wěn)定的分子機(jī)制屬于生命科學(xué)基礎(chǔ)層面上的自然規(guī)律。它對(duì)于揭示許多重大疾病(如癌癥、衰老退化性疾病-阿爾茨海默癥等)的發(fā)病機(jī)制，闡明生命現(xiàn)象(如細(xì)胞干性、原生質(zhì)變異等)，突破限制干細(xì)胞治療治療的瓶頸(如腫瘤發(fā)生)，具有重要的理論與實(shí)際意義。
[0028]從技術(shù)層面或方法學(xué)上，本發(fā)明還可為研究其它DNA結(jié)合分子，以及適合于本發(fā)明技術(shù)方法的分子結(jié)合作用分析提供一種實(shí)驗(yàn)檢測(cè)手段。
[0029]本發(fā)明能夠說(shuō)明細(xì)胞在非生理的化學(xué)、物理以及炎癥因素干預(yù)下，從其生長(zhǎng)的基質(zhì)上脫離所產(chǎn)生的細(xì)胞收縮、細(xì)胞核壓縮以及染色質(zhì)適形變化會(huì)導(dǎo)致SSBs結(jié)合狀態(tài)的改變，即未結(jié)合的SSBs與結(jié)合的SSBs的分離。這種分離說(shuō)明由SSBs所參與組裝的DNA復(fù)制與修復(fù)復(fù)合體的去組裝，結(jié)果是導(dǎo)致細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定。
[0030]應(yīng)用本發(fā)明所揭示的這種SSBs結(jié)合狀態(tài)改變的自然規(guī)律，可解釋一系列困擾生命科學(xué)領(lǐng)域的眾多重要與疾病以及應(yīng)用研究相關(guān)的科學(xué)謎題。在經(jīng)典假說(shuō)與理論方面，這一發(fā)現(xiàn)使得一項(xiàng)半個(gè)多世紀(jì)的科學(xué)謎題的背后機(jī)理從科學(xué)邏輯上得到更完善的解釋。1961年由美國(guó)科學(xué)家海弗里克(Leonard Hayflick)提出的著名假說(shuō)——海弗里克極限(Hayflick limit)被譽(yù)為了生物學(xué)的頂梁柱(pillar of b1logy)。該假說(shuō)認(rèn)為細(xì)胞只能群體倍增(populat1n doublings)約50代,其后細(xì)胞便進(jìn)入增殖性衰老死亡。關(guān)于這一假說(shuō)的機(jī)理，諾貝爾獎(jiǎng)得主卡洛爾.格雷德(Carol ff.Greider)等人于1990年在國(guó)際著名雜志Nature上發(fā)表文章提示這種增殖性衰老是由端粒的縮短造成的。這一端?？s短理論至今仍成為解釋海弗里克極限機(jī)理的主流學(xué)術(shù)觀點(diǎn)。即細(xì)胞每經(jīng)一輪DNA復(fù)制端粒會(huì)出現(xiàn)一定量的縮短，當(dāng)縮短到一定程度時(shí)，細(xì)胞將出現(xiàn)增殖性衰老死亡。但是端?？s短到何等長(zhǎng)度即觸發(fā)細(xì)胞增殖性衰老死亡，迄今只有推斷長(zhǎng)度，沒(méi)有嚴(yán)格的確定長(zhǎng)度。然而，根據(jù)由本發(fā)明方法所得實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行的深入實(shí)驗(yàn)