基于質(zhì)譜的氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)的分析方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]一種基于質(zhì)譜的氧連接氮乙酰葡糖胺(Ο-GlcNAc)修飾糖蛋白質(zhì)分析方法。所述的O-GlcNAc修飾糖蛋白質(zhì)蛋白酶酶解后生成肽段，利用高碘酸鈉氧化，修飾基團(tuán)氮乙酰葡糖胺上的對位輕基進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)形成兩個(gè)酸基基團(tuán)，利用吉拉德試劑T(Girard ReagentT)上的酰阱和新生成的醛基反應(yīng)，從而使Ο-GlcNAc修飾糖肽的化學(xué)衍生上季銨鹽基團(tuán)。季銨鹽基團(tuán)的存在能夠有效地增強(qiáng)肽段的質(zhì)譜響應(yīng)信號，并且衍生后的糖肽在保留一定原糖修飾基團(tuán)，進(jìn)行后續(xù)質(zhì)譜，通過數(shù)據(jù)庫搜索等分析手段對該種糖基修飾的糖蛋白質(zhì)進(jìn)行分析鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002]氧連接氮乙酰葡糖胺修飾是一種發(fā)生在蛋白質(zhì)絲氨酸及蘇氨酸殘基上的翻譯后修飾，是一種真核細(xì)胞內(nèi)重要的單糖翻譯后修飾，在細(xì)胞內(nèi)信號通路中扮演重要作用。然而，該種翻譯后修飾的糖蛋白糖蛋白質(zhì)的研究存在諸多難點(diǎn):豐度低、糖肽占總肽段比例小，質(zhì)譜信號響應(yīng)低，沒有將修飾基團(tuán)切除的特異性試劑等。
[0003]文獻(xiàn)報(bào)道中對該種糖蛋白質(zhì)常用的研究方法主要有酶促衍生富集法和凝集素親和法。另外最近有文獻(xiàn)(Journal of Proteome Research 2010, 9, 2200 - 2206)報(bào)道了一種利用高碘酸鈉氧化氮乙酰葡糖胺形成醛基，利用酰阱凝膠富集研究該種糖蛋白的工作，該工作開發(fā)了利用化學(xué)手段研究氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)的手段，相較昂貴的酶促衍生手段，為廉價(jià)大規(guī)模研究氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)提供可能。
[0004]氧連接氮乙酰葡糖胺(O-GlcNAc)的修飾會抑制蛋白及肽的質(zhì)譜響應(yīng)信號，因此增強(qiáng)該糖肽的質(zhì)譜響應(yīng)信號對其基于質(zhì)譜的分析鑒定將有極大的幫助。在蛋白質(zhì)或肽段上衍生上季銨鹽基團(tuán)在增強(qiáng)樣品質(zhì)譜信號，改變樣品電荷等方面有著廣泛的應(yīng)用。因此，我們通過季銨鹽基團(tuán)的修飾能有效地提高質(zhì)譜信號，為后續(xù)的質(zhì)譜分析研究提供幫助。
[0005]氧連接糖肽的二級質(zhì)譜碎裂中，在CID碎裂模式下，碰撞碎裂能量往往集中于糖鏈的碎裂，無法獲得較好的肽段碎裂信息。本方法中，在對修飾的氮乙酰葡糖胺基團(tuán)進(jìn)行了吉拉德試劑T的化學(xué)衍生，使其修飾的肽段在CID碎裂模式下能夠得到較好的碎片信息。同時(shí)該方法也保留了部分氮乙酰葡糖胺基團(tuán)的結(jié)構(gòu)信息，利用二級質(zhì)譜譜圖的特征峰離子可有效提高譜圖分析的可信度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]衍生上季銨鹽基團(tuán)能夠增強(qiáng)樣品質(zhì)譜信號，同時(shí)該化學(xué)衍生有利于肽段獲得較好的CID 二級碎裂，為后續(xù)數(shù)據(jù)庫搜索獲得良好的肽段鑒定結(jié)果提供幫助。本發(fā)明的目的是提供一種對氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽的質(zhì)譜分析方法，該方法通過對該糖基化修飾的化學(xué)衍生提高了糖肽質(zhì)譜信號，并能夠獲得良好的二級質(zhì)譜碎片信息。使后續(xù)的數(shù)據(jù)庫搜索能夠更好地鑒定氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
[0008]O-GlcNAc修飾糖蛋白質(zhì)蛋白酶酶解后生成肽段，利用高碘酸鈉氧化，修飾基團(tuán)氮乙酰葡糖胺上的對位羥基進(jìn)行開環(huán)反應(yīng)形成兩個(gè)醛基基團(tuán)，利用吉拉德試劑T(GirardReagent T)上的酰阱和新生成的醛基反應(yīng)，從而使Ο-GlcNAc修飾糖肽的化學(xué)衍生上季銨鹽基團(tuán)。季銨鹽基團(tuán)的存在能夠有效地增強(qiáng)肽段的質(zhì)譜響應(yīng)信號，并且衍生后的糖肽在保留一定原糖修飾基團(tuán)，進(jìn)行后續(xù)質(zhì)譜，通過數(shù)據(jù)庫搜索等分析手段對該種糖基修飾的糖蛋白質(zhì)進(jìn)行分析鑒定。
[0009]所述氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析方法，具體步驟如下:
[0010](1)蛋白質(zhì)樣品的酶解:對蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行變性還原烷基化后進(jìn)行酶解，獲得作為酶解產(chǎn)物的肽段。每100 μ g蛋白質(zhì)加入3-6 μ 1 1Μ 二硫蘇糖醇(DTT)，50_60°C反應(yīng)1_2小時(shí)。之后加入8-12μ1 1Μ碘乙酸(ΙΑΑ)，避光反應(yīng)10-30分鐘。將處理后的蛋白質(zhì)樣品利用碳酸氫銨緩沖液稀釋，pH值控制7.5-8.5之間，每100 μ g蛋白質(zhì)加入2-5 μ g胰蛋白酶進(jìn)行酶解，36-38°C反應(yīng)16-24小時(shí)。酶解肽段利用反相液相色譜除去碳酸氫銨等小分子鹽，冷凍干燥后獲得肽段樣品，為避免肽段N末端是絲氨酸或蘇氨酸殘基時(shí)存在的副反應(yīng)，對獲得的肽段樣品進(jìn)行甲醛二甲基化方法封閉N末端氨基。每100 μ g肽段加入3-5%甲醛溶液10-25 μ 1,0.5-0.8mM氰基硼氫化鈉10-25 μ 1，反應(yīng)0.5-2小時(shí)，反相除鹽去除甲醛和氰基硼氫化鈉。
[0011](2)氮乙酰葡糖胺基團(tuán)氧化:在pH = 5-6的50mM乙酸鈉緩沖溶液中，氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)或糖肽樣品與濃度為20-30mM的過量高碘酸鈉溶液反應(yīng)；反應(yīng)溫度35-40°C，反應(yīng)時(shí)間4-8小時(shí)。氧化反應(yīng)結(jié)束后，對于過量的高碘酸鈉，加入4-6倍于高碘酸鈉摩爾量亞硫酸鈉，反應(yīng)10-40分鐘，終止氧化反應(yīng)。
[0012](3)吉拉德試劑衍生反應(yīng):將經(jīng)過高碘酸鈉氧化的糖蛋白質(zhì)樣品于濃度為10-100mM的吉拉德試劑混合，反應(yīng)1-6小時(shí)。反應(yīng)過程在pH = 5-6的乙酸鈉溶液中進(jìn)行。
[0013](4)采用反相液相色譜分離除去未反應(yīng)吉拉德試劑:采用反相C18或C8色譜住，流動相A:2%乙腈，98%水及0.1%三氟乙酸。流動相B:98%乙腈，2%水及0.1%三氟乙酸。采用2%流動相B上樣，之后用上樣緩沖液沖洗沖洗色譜柱5-15分鐘，之后用80%流動相將糖蛋白質(zhì)或糖肽樣品洗脫下來，冷凍干燥。
[0014](5)采用液質(zhì)聯(lián)用，對肽段進(jìn)行分離后采用質(zhì)譜進(jìn)行樣品分析:利用碰撞誘導(dǎo)解離(Collis1n-1nduced dissociat1n, CID)模式對肽段進(jìn)行二級碎裂，對于離子講質(zhì)譜，CID能量控制在30-50%。采集數(shù)據(jù)利用蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫搜索引擎進(jìn)行糖肽的信息利用分析。
[0015](6)采集數(shù)據(jù)利用蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫搜索引擎進(jìn)行糖肽的信息利用分析:數(shù)據(jù)庫搜索的參數(shù)設(shè)置中，針對氧連接氮乙酰葡糖胺修飾，增加可變修飾的設(shè)置:1)修飾分子式C13H22N405,修飾位點(diǎn)絲氨酸和蘇氨酸殘基。2)修飾分子式C1SH33N705，修飾位點(diǎn)絲氨酸和蘇氨酸殘基。針對二甲基化修飾，增加可變修飾:1)修飾分子式C2H4，修飾位賴氨酸殘基。2)修飾分子式C2H4，修飾位點(diǎn)肽段氮末端。搜庫結(jié)果進(jìn)一步處理，為增加結(jié)果的可信度，利用二級質(zhì)譜圖中的特征峰進(jìn)行進(jìn)一步篩選。對于修飾了一分子吉拉德試劑T的修飾肽段，二級譜中應(yīng)包含特征峰M/z = 315.16，對于修飾了兩分子吉拉德試劑T的修飾肽段，二級譜中應(yīng)包含特征峰M/z = 214.625。
[0016]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
[0017]1.本發(fā)明在氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽上衍生季銨鹽基團(tuán)，增強(qiáng)樣品質(zhì)譜信號。
[0018]2.本發(fā)明衍生的氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽，保留了部分原氮乙酰葡糖胺的基團(tuán)，為后續(xù)質(zhì)譜解譜分析提供信息。
[0019]3.本發(fā)明利用化學(xué)方法衍生的氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)及糖肽，更加廉價(jià)，有利于大量大規(guī)模樣品分析。
[0020]4.本發(fā)明衍生后的肽段能夠在CID模式下獲得較好的二級譜圖，利于后續(xù)的數(shù)據(jù)庫檢索分析。
【附圖說明】
[0021]圖1氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)化學(xué)衍生及質(zhì)譜分析流程圖；
[0022]圖2氧連接氮乙酰葡糖胺修飾標(biāo)肽TAPTSgTIAPG衍生后MALDI質(zhì)譜；
[0023]圖3標(biāo)肽TAPTSgTIAPG衍生前后質(zhì)譜信號增強(qiáng)幅度比較圖a) MALDI衍生肽段與未衍生肽段1:5混合，b)LTQ衍生肽段與未衍生肽段1:1混合；
[0024]圖4衍生后標(biāo)肽TAPTSgTIAPG的CID模式下二級質(zhì)譜圖a)修飾了兩分子吉拉德試劑T的肽段二級質(zhì)譜圖，b)修飾了一分子吉拉德試劑T的肽段二級質(zhì)譜圖；
[0025]圖5衍生后標(biāo)肽TAPTSgTIAPG的CID模式下碎裂模式示意圖a)修飾了兩分子吉拉德試劑T的肽段二級碎裂模式，b)修飾了一分子吉拉德試劑T的肽段二級碎裂模式。
【具體實(shí)施方式】
[0026]下面通過實(shí)施例對本發(fā)明提供的方法進(jìn)行詳述，但不以任何形式限制本發(fā)明。
[0027]實(shí)施例1
[0028]氧連接氮乙酰葡糖胺修飾標(biāo)準(zhǔn)糖肽的吉拉德試劑標(biāo)記:
[0029]1.如圖1所示，按如下流程操作:
[0030]1)標(biāo)準(zhǔn)糖肽N末端二甲基化封閉:取10 μ g肽段TAPTSgTIAPG加入4%甲醛溶液1 μ 1，0.6mM氰基硼氫化鈉1 μ 1，反應(yīng)0.5小時(shí)，反相除鹽去除甲醛和氰基硼氫化鈉。
[0031]2)氮乙酰葡糖胺基團(tuán)氧化:在pH = 5.5的50mM乙酸鈉緩沖溶液中，糖肽樣品與濃度為20mM高碘酸鈉溶液反應(yīng)?’反應(yīng)溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間6小時(shí)。氧化反應(yīng)結(jié)束后，加入5倍于高碘酸鈉摩爾量亞硫酸鈉，反應(yīng)20分鐘，終止氧化反應(yīng)。
[0032]3)吉拉德試劑衍生反應(yīng):將經(jīng)過高碘酸鈉氧化的糖肽樣品于濃度為50mM的吉拉德試劑T混合，反應(yīng)2小時(shí)。反應(yīng)過程在pH = 5.5的50mM乙酸鈉溶液中進(jìn)行。采用反相液相色譜分離除去未反應(yīng)吉拉德試劑。
[0033]2.所衍生后的標(biāo)肽的MALDI質(zhì)譜圖如圖2所示
[0034]3.由分子量計(jì)算得知，一分子標(biāo)肽與一分子吉拉德試劑T反應(yīng)，沒有明顯的未反應(yīng)的標(biāo)肽峰。因此可認(rèn)為該標(biāo)肽的標(biāo)記效率接近完全。
[0035]實(shí)施例2
[0036]蛋白質(zhì)樣品的酶解和標(biāo)記:
[0037](1)對鼠腦樣品提取蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行變性還原烷基化后進(jìn)行酶解??每100μ g提取蛋白質(zhì)加入4μ1 1Μ 二硫蘇糖醇(DTT)，56°C反應(yīng)1.5小時(shí)。之后加入8μ1 1Μ碘乙酸(IAA)，避光反應(yīng)30分鐘。將處理后的蛋白質(zhì)樣品利用碳酸氫銨緩沖液稀釋，pH = 8。每100 μ g蛋白質(zhì)加入4 μ g胰蛋白酶進(jìn)行酶解，37°C反應(yīng)24小時(shí)。酶解肽段利用反相液相色譜除去碳酸氫銨等小分子鹽，冷凍干燥后獲得的肽段樣品進(jìn)行甲醛二甲基化方法封閉N末端氨基。每100 μ g肽段加入4%甲醛溶液15 μ 1，0.6mM氰基硼氫化鈉15 μ 1，反應(yīng)0.5小時(shí)，反相除鹽去除甲醛和氰基硼氫化鈉。
[0038](2)氮乙酰葡糖胺基團(tuán)氧化:在pH = 5.5的50mM乙酸鈉緩沖溶液中，氧連接氮乙酰葡糖胺修飾糖蛋白質(zhì)或糖肽樣品與濃度為20mM高碘酸鈉溶液反應(yīng)；反應(yīng)溫度37°C，反應(yīng)時(shí)間6小時(shí)。氧化反應(yīng)結(jié)束后，加入5倍于高碘酸鈉摩爾量亞硫酸鈉，反應(yīng)30分鐘，終止氧化反應(yīng)。
[0039](3)吉拉德試劑衍生反應(yīng):將經(jīng)過高碘酸鈉氧化的糖蛋白質(zhì)樣品于濃度為50mM的吉拉德試劑混合,反應(yīng)6小時(shí)。反應(yīng)過程在pH = 5.5的乙酸鈉溶液中進(jìn)行。
[0040](4)采用反相液相色譜分離除去未反應(yīng)吉拉德試劑:采用反相C18或C8色譜住，流動相A:2%乙腈，98%水及0.1%三氟乙酸。流動相B:98%乙腈，2%水及0.1%三氟乙酸。采用2%流動相B上樣，之后用上樣緩沖液沖洗沖洗色譜柱10分鐘，之后用80%流動相將糖蛋白質(zhì)或糖肽樣品洗脫下來，冷凍干燥。
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