一種牛布魯氏菌elisa檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及蛋白質(zhì)工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地，設(shè)及一種W牛布魯氏菌外膜蛋白為檢 測(cè)抗原的牛布魯氏菌ELISA檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 布魯氏菌病是一種在世界范圍內(nèi)影響嚴(yán)重的人畜共患病。布魯氏菌病是由布魯氏 菌引起的，主要侵害動(dòng)物的生殖系統(tǒng)，引起流產(chǎn)和不孕不育，帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。確診布 病的診斷方法是對(duì)致病微生物的分離培養(yǎng)鑒定。
[0003] 目前在血清學(xué)診斷方法上，大部分都是基于檢測(cè)抗布魯菌脂蛋白（脂多糖，LPS)的 抗體，雖然虎紅平板凝集和補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)在世界范圍內(nèi)最認(rèn)可和接受的測(cè)試，但是由于實(shí) 驗(yàn)結(jié)果有交叉性，實(shí)驗(yàn)操作步驟繁瑣、費(fèi)時(shí)等垢病，在實(shí)際操作中應(yīng)用較少。ELISA檢測(cè)方法 易于操作，特異性、靈敏性高，在布魯菌血清學(xué)診斷中很有前景，但是基于布魯菌全菌作為 診斷抗原，不可避免出現(xiàn)假陽(yáng)性、假陰性，造成誤判，并且基于檢測(cè)布魯氏菌LPS的化ISA方 法不能區(qū)分自然感染和疫苗感染的缺陷。因此很有必要研發(fā)一種既不使用全菌也不使用脂 蛋白LF*S的診斷抗原。
[0004] 外膜蛋白0MP，不僅是布魯氏菌結(jié)構(gòu)蛋白和功能蛋白，而且也是布魯氏菌重要的抗 原和毒力因子，對(duì)維持布魯氏菌細(xì)胞膜的完整性和選擇性至關(guān)重要。然而遺憾的是在布魯 氏菌如何生存和致病力感染中，外膜蛋白0MP起到的作用尚未被人知曉。外膜蛋白0MP28已 經(jīng)被全面的研究了，在作為化ISA診斷抗原上具有較好的反應(yīng)原性和特異性，也可W作為候 選疫苗。但將0MP19、0MP22、0MP28多種蛋白混合后用于布魯氏菌的診斷還未有研究報(bào)道。
[0005] pCold-TF載體在His-tag序列和多克隆位點(diǎn)之間插入了TriggerF'actoHTF)基 因。Trigger化ctor是一種原核細(xì)胞的核糖體結(jié)合伴侶蛋白，能夠促進(jìn)新生膚鏈的共翻譯 蛋白的可溶性。通過TF的可溶性標(biāo)記功能和分子伴侶作用，可W使一些難W表達(dá)的基因獲 得更高概率的可溶性表達(dá)；pColdTF載體的啟動(dòng)子為冷激蛋白CspA(Coldshock proteins),決定著目的基因表達(dá)過程中要采取15°C左右的低溫培養(yǎng)。低溫培養(yǎng)能降低蛋白 質(zhì)合成的速率，改變多膚折疊的動(dòng)力學(xué)，從而導(dǎo)致正確折疊的蛋白增加，運(yùn)是pColdTF載體 的優(yōu)點(diǎn)之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種牛布魯氏菌化ISA檢測(cè)試劑盒。
[0007] 本發(fā)明通過W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):構(gòu)建包含牛布魯氏菌外膜蛋白基因0MP19、0MP22、 0MP28的表達(dá)載體，通過將Ξ種基因的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，得到牛布魯氏菌外 膜蛋白0MP19、0MP22、0MP28表達(dá)工程菌;經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá);將表達(dá)產(chǎn)物過儀-NTA瓊脂糖樹脂 層析柱，洗脫得到純化的牛布魯氏菌外膜蛋白01口19、01口22、01口28。然后將純化的立種蛋白 按比例W混合后用于包被化ISA酶標(biāo)板，作為檢測(cè)抗原，用于檢測(cè)牛布魯氏菌。
[000引本發(fā)明提供一種牛布魯氏菌化ISA檢測(cè)試劑盒，W牛布魯氏菌外膜蛋白0MP19、 0MP22、0MP28混合抗原作為化ISA酶標(biāo)板的包被抗原。
[0009] 進(jìn)一步地，本發(fā)明的試劑盒中，所述包被抗原是將濃度均為lyg/ml的0MP19、 0MP22、0ΜΡ28Ξ種蛋白按照體積比1:1:1混合得到。
[0010] 本發(fā)明的試劑盒還含有馬血清，牛布魯氏菌陰性、陽(yáng)性血清，酶標(biāo)二抗，洗涂液，酶 標(biāo)抗體稀釋液，底物顯色液，終止液。
[0011] 本發(fā)明試劑盒所使用的牛布魯氏菌外膜蛋白0ΜΡ19通過W下方法制備得到：合成 0ΜΡ19基因，序列如沈QIDNO. 1所示;將0ΜΡ19基因與pCo1d-TF載體分別用BamH巧日趾01雙 酶切，將酶切后的0MP19基因與pCold-TF載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞得到重組表達(dá) 載體pCold-TF/0MP19;將重組表達(dá)載體pCold-TF/0MP19轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，制得牛布魯氏 菌外膜蛋白0MP19表達(dá)工程菌;經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá);將表達(dá)產(chǎn)物過儀-NTA瓊脂糖樹脂層析柱， 洗脫得到純化的牛布魯氏菌外膜蛋白0MP19。
[0012] 所述0MP19基因是W布魯氏菌DNA為模板，SEQID^.7-8所示的引物進(jìn)行?0?擴(kuò)增 得到的。
[OOU]F〇mpi9 5'-cgcggatccATGGGAATTTCAAAAGCAAG-3'（沈QIDNO.7)
[0014] R〇mpi9 5'-ccgctcga巧CAGCGCGACAGCGTCAC-3'（沈QIDNO.8)
[0015] PCR反應(yīng)條件為：95°C，5min; 95°C，30s，57°C，45s，72°C，Imin，35個(gè)循環(huán)；72°C， 1Omin，4°C保存。1.5%瓊脂糖凝膠回收目的基因片段。
[0016] 本發(fā)明試劑盒所使用的牛布魯氏菌外膜蛋白0MP22通過W下方法制備得到：合成 0MP22基因，序列如沈QID^.2所示;將01?22基因與口(：〇1(1-了。載體分別用8曰111刖和趾〇1雙 酶切，將酶切后的0MP22基因與pCold-TF載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞得到重組表達(dá) 載體pCold-TF/0MP22;將重組表達(dá)載體pCold-TF/0MP22轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，制得牛布魯氏 菌外膜蛋白0MP22表達(dá)工程菌;經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá);將表達(dá)產(chǎn)物過儀-NTA瓊脂糖樹脂層析柱， 洗脫得到純化的牛布魯氏菌外膜蛋白0MP22。
[0017] 所述0MP22基因是W布魯氏菌DNA為模板，SEQID^).9-10所示的引物進(jìn)行口〇?擴(kuò) 增得到的。
[001 引F0mp225'-cgcggatccATGTTCAAGCGTTCTATC-3'（沈QIDNO.9),
[0019] R〇mp225'-ccgctcgagCTAGAATTTGTAGTTCAG-3'（沈QIDNO. 10);
[0020] PCR反應(yīng)條件為：95°C，5min; 95°C，30s，57°C，45s，72°C，Imin，35個(gè)循環(huán)；72°C， 1Omin，4°C保存。1.5%瓊脂糖凝膠回收目的基因片段。
[0021] 本發(fā)明試劑盒所使用的牛布魯氏菌外膜蛋白0MP28通過W下方法制備得到：合成 0MP28基因，序列如沈QID^.3所示;將01?28基因與口(：〇1(1-了。載體分別用8曰111刖和趾〇1雙 酶切，將酶切后的0MP28基因與pCold-TF載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞得到重組表達(dá) 載體pCold-TF/0MP28;將重組表達(dá)載體pCold-TF/0MP28轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細(xì)胞，制得牛布魯氏 菌外膜蛋白0MP28表達(dá)工程菌;經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá);將表達(dá)產(chǎn)物過儀-NTA瓊脂糖樹脂層析柱， 洗脫得到純化的牛布魯氏菌外膜蛋白0MP28。
[0022] 所述0MP28基因是W布魯氏菌DNA為模板，SEQID^.11-12所示的引物進(jìn)行?0?擴(kuò) 增得到的。
[0023] F〇mp285'-cgcggatccATGAACACTCGTGCTAGC-3'（沈QIDNO.11),
[0024] R〇mp285'-ccgctcga巧TACTTGATTTCAAAAACG-3'（沈QIDNO. 12)。
[0025]下劃線出分別為BamHI、XhoI酶切位點(diǎn)。
[00%]PCR反應(yīng)條件為：95°C，5min; 95°C，30s，57°C，45s，72°C，Imin，35個(gè)循環(huán)；72°C， 1Omin，4°C保存。1.5%瓊脂糖凝膠回收目的基因片段。
[0027] 本發(fā)明提供了牛布魯氏菌外膜蛋白0MP19、0MP22、0MP28的混合抗原在制備檢測(cè)牛 布魯氏菌試劑盒中的應(yīng)用。
[0028] 本發(fā)明的化ISA檢測(cè)試劑盒可W彌補(bǔ)國(guó)內(nèi)牛布魯氏菌檢定方法的不足。僅需要2個(gè) 小時(shí)就能測(cè)得結(jié)果（IDEXX試劑盒需要4小時(shí)左右才能測(cè)得結(jié)果），且檢測(cè)靈敏度、準(zhǔn)確度高， 運(yùn)用本發(fā)明檢測(cè)試劑盒檢測(cè)牛布魯氏菌最低檢測(cè)限為血清1:1600。在建立混合抗原化ISA 檢測(cè)方法過程中，為降低背景值，本發(fā)明使用了無關(guān)血清，即10%的馬血清作為封閉液，較 常用的封閉液5%脫脂乳、1%BSA，能夠大大降低背景值。本發(fā)明試劑盒便于操作、使用成本 低(本試劑盒耗材不超過500元，而購(gòu)買IDEXX試劑盒的花費(fèi)為3000元）、穩(wěn)定性和重復(fù)性好， 適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。
【附圖說明】
[0029] 圖1為Ξ種牛布魯氏菌外膜蛋白基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果圖，其中Μ為化2000Marker， 泳道1、2、3分別為0MP28、0MP22、0MP19基因的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果。
[0030] 圖2重組載體酶切鑒定圖，其中Μ為化2000Marker，泳道1、2、3分別為pCold-TF/ 0MP19、pCold-TF/0MP22、pCold-TF/0MP28 載體的雙酶切產(chǎn)物。
[0031] 圖3純