基于凝血酶與顯色基質(zhì)相互作用的抗凝血酶iii快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥體外診斷試劑領(lǐng)域，具體涉及一種基于凝血酶與顯色基質(zhì)相 互作用的抗凝血酶III快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 發(fā)色底物法檢測(cè)的原理為：人工合成一種可以被待測(cè)凝血活酶催化裂解的化合 物，此化合物連接上一種顯色基質(zhì)，在檢測(cè)過(guò)程中產(chǎn)色物質(zhì)可被解離下來(lái)，使被檢樣品中出 現(xiàn)顏色變化，根據(jù)顏色變化可推算出被檢凝血活酶的活性。產(chǎn)色物質(zhì)一般選用連接對(duì)硝基 苯胺(ΡΝΑ)。
[0003] 目前該方法常用于生化分析儀和分光光度計(jì)等設(shè)備上，游離的ΡΝΑ呈黃色，其測(cè)定 波長(zhǎng)一般選用405nm。在這一波長(zhǎng)下，其它物質(zhì)對(duì)光的吸收小于ρΝΑ對(duì)光吸收的1 %。具體檢 測(cè)方法既可采用動(dòng)態(tài)法、也可采用終點(diǎn)法。動(dòng)態(tài)法即是連續(xù)記錄樣品的吸光度變化，算出單 位時(shí)間吸光度的變化量，并以每分鐘吸光度的變化來(lái)報(bào)告結(jié)果。終點(diǎn)法即是指在活性酶同 產(chǎn)色物質(zhì)作用一段時(shí)間后，加入乙酸終止反應(yīng)，檢測(cè)此段時(shí)間內(nèi)吸光度的變化，進(jìn)而推算出 待檢酶的活性。
[0004] 使用產(chǎn)色物質(zhì)在檢測(cè)血栓/止血指標(biāo)時(shí)大致可分成三種模式。
[0005] (1)酶的檢測(cè)：即在含酶的樣品中直接加入產(chǎn)色物質(zhì)，因?yàn)槊缚闪呀猱a(chǎn)色物質(zhì)釋放 ρΝΑ，監(jiān)測(cè)由于ρΝΑ釋放而導(dǎo)致被檢樣品在405nm處光吸收的變化，就可推算樣品中酶的活 性。如對(duì)凝血酶、纖溶酶等的檢測(cè)。
[0006] (2)對(duì)酶原的檢測(cè)：要對(duì)某種酶原進(jìn)行測(cè)定，必須先用激活劑將其激活，使其活化 位點(diǎn)暴露，才可將產(chǎn)色物質(zhì)上的ρΝΑ裂解下來(lái)。加入的激活劑必須過(guò)量，因?yàn)橹挥羞@樣才能 使酶原被全部激活，酶原的量才會(huì)同樣品中酶的活性成一定的數(shù)量關(guān)系。樣品中酶的活性 可通過(guò)ρΝΑ釋放，即樣品吸光度的變化反應(yīng)出來(lái)，由此則可推算出樣品中酶原的含量。
[0007] (3)酶抑制物的檢測(cè):首先往待檢樣品中加入過(guò)量對(duì)應(yīng)的酶中和該抑制物，剩余的 酶可裂解產(chǎn)色物質(zhì)釋放ρΝΑ，監(jiān)測(cè)由于ρΝΑ釋放而導(dǎo)致光吸收的變化，就可測(cè)出酶的活性，進(jìn) 而可推算出樣品中抑制物的含量。如對(duì)抗凝血酶ΙΠ (ΑΤ-ΙΠ )等。
[0008] 現(xiàn)在的診斷技術(shù)正在向大型集成化和簡(jiǎn)單快速化兩個(gè)方向發(fā)展，顯色底物法在體 外診斷行業(yè)，尤其是血栓與止血領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛，且檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性良好，但是現(xiàn)有的 顯色底物法的測(cè)試必須使用配套的儀器才能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。然而在很多時(shí)候，如條件不允許的 情況下(沒(méi)有儀器或儀器沒(méi)有這項(xiàng)功能的時(shí)候)就不能開(kāi)展該方面的檢測(cè)項(xiàng)目。當(dāng)只需要簡(jiǎn) 單快速的判斷大致含量或者只需定性判斷陰陽(yáng)性的時(shí)候，現(xiàn)有的顯色底物法的檢測(cè)方法就 比較欠缺。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，目的在于提供一種基于凝血酶與顯色基質(zhì)相互作用 的抗凝血酶III快速檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法。
[0010]為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：
[0011] 一種基于凝血酶與顯色基質(zhì)相互作用的抗凝血酶in快速檢測(cè)試劑盒，包括R1試 劑、R2試劑、終止液和顯色測(cè)定卡，所述R1試劑包含肝素、凝血酶，所述R2試劑包含發(fā)色底物 試劑，所述顯色測(cè)定卡上有比色參考帶和反應(yīng)池，所述比色參考帶上分為由深至淺的6個(gè)黃 色區(qū)域，從深至淺分別對(duì)應(yīng)抗凝血酶III的活性20%、40%、60%、80%、100%、> 100%。
[0012] 上述方案中，所述發(fā)色底物試劑各組分的配比為：發(fā)色底物5116 0.2511^/1111、1'1^8-HC1 50mM、pH8.4、吐溫-20 lwt%、PEG8000 lwt%、海藻糖3.5wt%和疊氮鈉 O.Olwt%。
[0013] 上述方案中，所述比色參考帶通過(guò)如下方法獲得:將抗凝血酶III標(biāo)準(zhǔn)品用生理鹽 水稀釋成一系列已知濃度的樣本，分別采用所述檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果為各反應(yīng) 池內(nèi)顯示的不同顏色的反應(yīng)液，將檢測(cè)結(jié)果使用數(shù)碼相機(jī)拍照成圖并用圖像處理軟件分 析，標(biāo)識(shí)出圖片在RGB模式下的R值、G值和B值，將所述R值、G值和B值用繪圖軟件整合并繪制 得到反應(yīng)液顏色與抗凝血酶III的活性相對(duì)應(yīng)的比色參考帶。
[0014] 上述方案中，所述R值和G值均為255，所述B值與抗凝血酶III的活性呈現(xiàn)良好的線 性關(guān)系，線性關(guān)系用函數(shù)定義為:Y = -0.318X+99.93，R2 = 0.999。
[0015] 上述方案中，所述反應(yīng)池采用梯形結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)。
[0016] 上述方案中，所述顯色測(cè)定卡采用PVC、PP、PE、LDPE或ABS材質(zhì)制備得到，其中，更 為優(yōu)選地，采用白色的PVC材質(zhì)制備得到。
[0017] 上述方案中，所述終止液的配方為:醋酸50wt %，疊氮鈉0.0 lwt %。
[0018] 上述方案中，所述R1試劑的配方為:凝血酶5000IU/L、肝素3000IU/L、Tris-甘氨酸 50mM，pH8.4、氯化鈉 175mM、甘露醇5wt%、Na2EDTA 0 · 2wt%、BSA 2wt%和疊氮鈉0 · lwt%。
[0019] 一種基于凝血酶與顯色基質(zhì)相互作用的抗凝血酶III快速檢測(cè)方法，其特征在于， 包括如下步驟：
[0020] (1)含抗凝劑的樣本血漿或樣本血清加入到反應(yīng)池中；
[0021 ] (2)向反應(yīng)池中加入R1試劑，混勻，使過(guò)量的凝血酶與抗凝血酶III充分反應(yīng)；
[0022] (3)再加入R2試劑，混勻，使剩余的凝血酶與發(fā)色底物試劑充分反應(yīng)；
[0023] (4)最后加入終止液，終止反應(yīng)；將反應(yīng)池中反應(yīng)液的顏色與比色參考帶進(jìn)行對(duì) 比，根據(jù)反應(yīng)液顏色與比色參考帶上6個(gè)區(qū)域顏色的接近程度，判斷抗凝血酶III的活性。
[0024] 上述方案中，所述樣本血漿或樣本血清:R1試劑:R2試劑:終止液的體積比為1:3: 1:0.5，步驟(2)所述過(guò)量的凝血酶與抗凝血酶III充分反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間為1分鐘;步驟(3)所 述剩余的凝血酶與發(fā)色底物試劑充分反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間為3分鐘。
[0025] 本發(fā)明的有益效果如下：（1)本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中顯色底物法檢測(cè)抗凝血酶 III活性必須使用配套的儀器、在儀器條件不允許的情況下無(wú)法展開(kāi)該項(xiàng)目的檢測(cè)的不足， 提供了一種可以快速半定量檢測(cè)抗凝血酶III活性的試劑盒及其檢測(cè)方法；（2)本發(fā)明通過(guò) 改進(jìn)發(fā)色底物配方，提高顯色反應(yīng)的裸眼可辨識(shí)度，成功地將抗凝血酶III的活性與裸眼可 辨識(shí)的顏色有效地關(guān)聯(lián)起來(lái)，制備得到了人眼可分辨的比色參考帶，解決了現(xiàn)有技術(shù)中檢 測(cè)結(jié)果的讀取必須依靠?jī)x器設(shè)備，無(wú)法肉眼判斷的技術(shù)問(wèn)題；（3)本發(fā)明檢測(cè)方法操作簡(jiǎn) 單，不需要使用配套儀器，只需要肉眼判斷就可以半定量的檢測(cè)獲得抗凝血酶III活性。
【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為本發(fā)明顯色測(cè)定卡的結(jié)構(gòu)示意圖，其中1為比色參考帶，2為反應(yīng)池。
[0027] 圖2為本發(fā)明反應(yīng)池的俯視圖和主視圖，其中3為俯視圖，4為主視圖。
[0028] 圖3為本發(fā)明檢測(cè)結(jié)果的B值與抗凝血酶III的濃度的線性關(guān)系圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029] 為了更好地理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明的內(nèi)容，但本發(fā)明的 內(nèi)容不僅僅局限于下面的實(shí)施例。
[0030] 實(shí)施例1檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
[0031] 一種基于凝血酶與顯色基質(zhì)相互作用的抗凝血酶III快速檢測(cè)試劑盒，包括R1試 劑、R2試劑、終止液和顯色測(cè)定卡。
[0032] 所述R1試劑為：凝血酶5000IU/L、肝素3000IU/L、Tris-甘氨酸50mM，pH8.4、氯化鈉 175mM、甘露醇5wt % (質(zhì)量濃度）、Na2EDTA 0 · 2wt %、BSA 2wt %和疊氮鈉1 lwt %。分裝凍 干，使用前用等體積純化水復(fù)溶。
[0033]所述R2試劑為：顯色